蓮子心總黃酮的大孔吸附樹(shù)脂純化及其抑菌活性

曾紹校，林志欽，陳 玲，許麗賓，鄭寶東(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

蓮子心又名薏、苦薏、蓮薏和蓮心等，屬于睡蓮科水生草本植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的胚根及幼葉.蓮子心含有黃酮類(lèi)物質(zhì)、生物堿、甾醇、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，使其有降血壓、消炎、抗氧化、止血、止渴等功效，具有極高的藥理研究?jī)r(jià)值［1－3］.黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的生理活性作用，如抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化及抗菌、抗病毒等作用［4－6］，但關(guān)于蓮子心總黃酮的純化及抑菌研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

黃酮類(lèi)化合物的分離純化方法主要有溶劑萃取法、柱層析法和高效液相色譜法.柱層析填充材料主要有硅膠、葡聚糖凝膠、聚酰胺和大孔吸附樹(shù)脂4種.其中，大孔吸附樹(shù)脂具有吸附效果好、再生簡(jiǎn)便、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可適用于大量生產(chǎn)［7－8］.

本試驗(yàn)在提取研究［9］的基礎(chǔ)上，研究大孔樹(shù)脂純化的蓮子心總黃酮對(duì)青霉、根霉、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用，并測(cè)定其最低抑菌濃度，旨在為蓮子心總黃酮的純化及作為天然防腐劑的開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

蓮子心產(chǎn)自福建建寧.

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單包桿菌(Pseudomonas)由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;青霉(Penicillium)、根霉(Rhizopus)由福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;沙門(mén)氏菌(Salmonella)由福建省疾控中心提供.

平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PDA)由杭州微生物試劑廠(chǎng)出品;15000 U·g－1纖維素酶由中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司出品;蘆丁對(duì)照品由拓康生物醫(yī)藥科技有限公司出品，純度≥98%;X-5型大孔吸附樹(shù)脂由南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)出品;氯化鈉、葡萄糖等試劑均為分析純(AR).

主要儀器與設(shè)備有101A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、L-530型臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)、AL104型電子天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)、PB-10型pH計(jì)(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)).

1.2 蓮子心總黃酮的測(cè)定

采用姜國(guó)芳等［10］的NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定蓮子心總黃酮的含量.根據(jù)測(cè)定結(jié)果，用最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程:Y=0.6174X+0.0011(R2=0.9999).式中，Y為光密度;X/(mg·mL－1)為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量.

取1 mL蓮子心總黃酮提取液，按上述方法進(jìn)行顯色后，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(xiàn)方程計(jì)算蓮子心總黃酮的含量.

1.3 蓮子心總黃酮的制備

干蓮子心除去雜質(zhì)和灰塵，粉碎，過(guò)60目篩后，按液料比為19∶1的比例加入50%乙醇，添加0.3%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至5.5，置60℃恒溫水浴鍋中酶解2 h，沸水浴滅酶5 min，離心過(guò)濾.過(guò)濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得蓮子心總黃酮粗濃縮液，冷凍干燥后即得蓮子心總黃酮樣品，備用.

1.4 X-5型大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

參考付艷麗等［11］的方法，稱(chēng)取一定量的X-5型大孔吸附樹(shù)脂(以下簡(jiǎn)稱(chēng)樹(shù)脂)，分別加入2倍體積的95%乙醇浸泡，至流出液加水(乙醇∶水=1∶5)無(wú)白色渾濁現(xiàn)象為止.用蒸餾水洗滌樹(shù)脂至樹(shù)脂不含乙醇(無(wú)醇味).用5%NaOH和10%HCl分別浸泡2－4 h，用蒸餾水洗至中性，浸在蒸餾水中，備用.

1.5 樹(shù)脂吸附條件的確定

1.5.1 上樣液含量的測(cè)定 取已活化的樹(shù)脂5 mL用蒸餾水沖洗，吸干其表面水分后，裝入150 mL的錐形瓶中.加入蓮子心總黃酮50 mL，置恒溫振蕩器上振蕩，溫度為25℃，振蕩速率為120 r·min－1，振蕩吸附3 h，取上清液測(cè)定蓮子心總黃酮的含量.

1.5.2 上樣液含量對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 取 pH 為 6，含量分別為 1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、6.1 mg·mL－1的蓮子心總黃酮進(jìn)行樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn).

1.5.3 上樣液 pH 對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 取含量為5.1 mg·mL－1，pH 分別為3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的蓮子心總黃酮，進(jìn)行樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn).

1.5.4 上樣液流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 取pH為6，含量為5.1 mg·mL－1的蓮子心總黃酮，分別以2、3、4 BV·h－1的流速加入裝有20 mL樹(shù)脂的層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn).

1.6 樹(shù)脂解析條件的確定

1.6.1 洗脫劑含量對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解析的影響 取吸附飽和后的樹(shù)脂5 mL置于150 mL錐形瓶中，分別加入50 mL去離子水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇，置25℃的恒溫水浴鍋上振蕩解析4 h，振蕩速率為120 r·min－1，過(guò)濾并測(cè)定洗脫劑中蓮子心總黃酮的含量，以確定最適的洗脫劑含量.

蓮子心總黃酮的解析率/%=樹(shù)脂吸附的蓮子心總黃酮量/樹(shù)脂解析的蓮子心總黃酮量×100.

1.6.2 洗脫劑流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解析的影響 取吸附平衡后的樹(shù)脂20 mL，以50%乙醇為洗脫劑，分別以2、3、4 BV·h－1的流速在層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn).收集流出液，每10 mL為一份，測(cè)定每一份流出液中的蓮子心總黃酮含量，以確定最佳的洗脫劑流速和用量.

1.7 蓮子心總黃酮抑菌活性的測(cè)定

1.7.1 菌種活化及菌懸液的制備 將青霉、根霉、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)2－3代(細(xì)菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，真菌用平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)).用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔制得菌液，配制成含菌數(shù)為106cfu·mL－1的菌懸液.

1.7.2 濾紙片法測(cè)定蓮子心總黃酮的抑菌活性 分別將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的各個(gè)無(wú)菌平皿分為4個(gè)區(qū)域.分別吸取0.20 mL菌懸液至平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng).參考周瑋婧等［12］的方法制備無(wú)菌濾紙片.將沾有蓮子心總黃酮的小濾紙片分別輕貼于培養(yǎng)基平板的4個(gè)區(qū)域中心，待干燥后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).霉菌于28℃培養(yǎng)24 h，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24－48 h.去掉濾紙片，測(cè)量抑菌直徑.

1.7.3 杯碟法測(cè)定蓮子心總黃酮的抑菌活性 分別將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的各個(gè)無(wú)菌平皿分為4個(gè)區(qū)域.分別吸取0.20 mL菌懸液至平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng).參考李谷才等［13］的方法制備無(wú)菌牛津杯.在涂好供試菌的培養(yǎng)基平板上均勻放置4個(gè)無(wú)菌牛津杯，分別移入0.1 mL蓮子心總黃酮，放置30 min后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).霉菌于28℃培養(yǎng)24 h，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24－48 h.移去牛津杯，測(cè)量抑菌直徑.

1.8 蓮子心總黃酮最低抑菌濃度的測(cè)定

分別用 8、6、4、2、1、0.5、0.25、0 mg·mL蓮子心總黃酮配制培養(yǎng)基，待冷卻后將細(xì)菌涂布于培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24－48 h.觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量抑菌直徑以確定蓮子心總黃酮的最低抑菌濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂吸附條件的確定

2.1.1 上樣液含量對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 由圖1可見(jiàn)，上樣液含量在一定范圍內(nèi)，樹(shù)脂的吸附量隨上樣液含量的增加而增大，但當(dāng)上樣液含量大于5.1 mg·mL－1后，吸附量增加的速度漸緩.故上樣液含量以5.1 mg·mL－1較適宜.

2.1.2 上樣液pH對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 由圖2可見(jiàn)，蓮子心總黃酮在樹(shù)脂上的吸附量受上樣液pH的影響.隨上樣液pH的增大，樹(shù)脂對(duì)其吸附量的變化整體上呈先上升后下降的趨勢(shì).當(dāng)上樣液pH為6時(shí)，吸附量最高.

圖1 上樣液含量對(duì)蓮子心總黃酮吸附量的影響Fig.1 Influence of sample concentration on adsorption

圖2 上樣液pH對(duì)蓮子心總黃酮吸附量的影響Fig.2 Influence of sample pH on adsorption

2.1.3 上樣液流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 由圖3可見(jiàn)，隨上樣液流速的加快，樹(shù)脂的吸附量隨之減小.這可能是因?yàn)樯蠘右毫魉俦容^慢時(shí)，被吸附的物質(zhì)與樹(shù)脂充分接觸，從而使樹(shù)脂的吸附量變大;當(dāng)流速過(guò)快時(shí)，被吸附的物質(zhì)來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂表面就流失掉，使上樣液提早泄漏，導(dǎo)致吸附量下降.綜合考慮吸附效果及泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間，選擇上樣液流速為2 BV·h－1，上樣量為2 BV.

2.2 樹(shù)脂解析條件的確定

2.2.1 洗脫劑含量對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解析的影響 由圖4可見(jiàn):蒸餾水和10%乙醇作為洗脫劑時(shí)，蓮子心總黃酮的解析率較低;50%乙醇的解析率最高(54.03%);乙醇含量超過(guò)50%時(shí)，解析率反而降低.因此選取50%乙醇為洗脫劑.

圖3 上樣液流速對(duì)蓮子心總黃酮吸附量的影響Fig.3 Influence of sample flow rate on adsorption

圖4 洗脫劑含量對(duì)蓮子心總黃酮解析率的影響Fig.4 Influence of eluent concentration on resin resolving

2.2.2 洗脫劑流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解析的影響 由圖5可見(jiàn)，洗脫劑在不同的流速下，1－4 BV洗脫劑中的蓮子心總黃酮含量較高.合并蓮子心總黃酮含量較高的洗脫劑，則不同流速的回收率不同.流速為2、3、4 BV·h－1時(shí)，回收率分別為 88.6%、83.6%、69.5%，流速越快，回收率越低.因此確定洗脫劑流速為2 BV·h－1.

2.2.3 蓮子心總黃酮純度的確定 采用最佳的工藝條件對(duì)蓮子心總黃酮進(jìn)行初步純化，獲得純蓮子心總黃酮，冷凍干燥后獲得粉末狀蓮子心總黃酮，測(cè)定其純度為50%.

圖5 洗脫劑流速對(duì)蓮子心總黃酮解析量的影響Fig.5 Influence of eluent flow rate on resin resolving

2.3 蓮子心總黃酮抑菌活性測(cè)定方法的確定

分別采用濾紙片法和杯碟法測(cè)定蓮子心總黃酮(4 mg·mL－1)的抑菌活性，結(jié)果如表1所示.

表1 不同方法測(cè)定的蓮子心總黃酮抑菌直徑Table 1 The antibacterial diameter of flavonoids from lotus plumule by using different measuring methods mm

表1顯示，杯碟法和濾紙片法測(cè)定的結(jié)果表現(xiàn)一致，抑菌活性強(qiáng)弱程度為:沙門(mén)氏菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞假單胞桿菌＞大腸桿菌.杯碟法的測(cè)定結(jié)果較濾紙片法明顯，因此選用杯碟法測(cè)定蓮子心總黃酮的抑菌活性.

2.4 蓮子心總黃酮的抑菌活性

配制相同含量(4 mg·mL－1)的蘆丁和蓮子心總黃酮，采用杯碟法測(cè)定其抑菌活性，用無(wú)菌生理鹽水做空白對(duì)照，結(jié)果如表2所示.

表2 蓮子心總黃酮的抑菌直徑1)Table 2 The bacteriostasis diameter of flavonoids from lotus plumule mm

表2顯示，蓮子心總黃酮和蘆丁對(duì)青霉、根霉均無(wú)明顯的抑菌作用，而對(duì)細(xì)菌有明顯的抑菌作用，蓮子心總黃酮的抑菌活性與蘆丁相近.

2.5 蓮子心總黃酮的最低抑菌濃度

配制7個(gè)不同含量的蓮子心總黃酮，觀察其對(duì)供試細(xì)菌的最低抑菌濃度，結(jié)果如表3所示.

表3 蓮子心總黃酮最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果1)Table 3 The lowest bacteriostasis consistence of flavonoids from lotus plumule

表3顯示，蓮子心總黃酮對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為 0.5、1、2、4、4 mg·mL－1.

3 結(jié)論

大孔吸附樹(shù)脂是由聚合單體和交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑等添加劑經(jīng)聚合反應(yīng)制備而成的一類(lèi)有機(jī)高聚物吸附劑［14］，具有吸附效果好、再生簡(jiǎn)便、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn).本試驗(yàn)采用X-5型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蓮子心總黃酮進(jìn)行純化的最佳工藝為:上樣液含量為5 mg·mL－1，上樣液pH為6，上樣量為2 BV，洗脫劑為4 BV 50%乙醇，洗脫劑流速為2 BV·h－1.經(jīng)驗(yàn)證，純化后蓮子心總黃酮的純度可達(dá)50%，且條件易滿(mǎn)足、成本低、效果明顯，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn).

采用杯碟法測(cè)定蓮子心總黃酮抑菌活性的結(jié)果表明，蓮子心總黃酮對(duì)青霉、根霉兩種真菌無(wú)明顯的抑菌作用，對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.5、1、2、4、4 mg·mL－1.蓮子心總黃酮的抑菌活性與蘆丁相近，揭示了其具有一定的生理活性和功能性開(kāi)發(fā)的價(jià)值.

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