大明竹屬部分植物ISSR-PCR反應體系優(yōu)化及有效引物篩選

黃樹軍，黃 婷，肖永太，榮俊冬，楊 陽，何天友，陳凌艷，鄭郁善，

(1.福建農林大學林學院;2.福建農林大學園林學院，福建 福州350002)

大明竹屬(Pleioblastus)植物隸屬竹亞科(Bambusoideae)，我國有20余種，多分布于長江中下游各地，分布零散［1］.該屬竹子形態(tài)優(yōu)美，生態(tài)凈化能力強，為庭園景觀綠化的優(yōu)良植物.

竹類植物的生長發(fā)育規(guī)律都較為特殊，以花、果實等形態(tài)為主的傳統(tǒng)植物分類方法對竹子進行分類較為復雜、困難，竹子分類不一［2－4］，學術上頗有爭議［5］.隨著現(xiàn)代分子生物技術的飛速發(fā)展，分子標記技術在竹子分類及遺傳多樣性研究方面得到了廣泛應用［6－11］，從分子水平上輔助分類［12］，有助于解決分類爭議，對鑒定種質資源起重要作用.簡單重復序列間擴增(inter simple sequence repeats，ISSR)是由Zietkiewicz提出，具有較好的穩(wěn)定性及多態(tài)性［13］.近年來，ISSR技術對竹類植物的研究報道較多，但關于大明竹屬植物的相關報道不多.目前大明竹屬部分植物的分類還存在爭議［14］，運用生物技術對大明竹屬植物的種間親緣關系的研究報道較少.利用ISSR技術可對大明竹屬植物的遺傳多樣性進行研究.ISSR技術基于PCR的擴增，該擴增體系受諸多因素的影響［15］.為了確定ISSR分析的可靠性，對ISSR-PCR反應體系及擴增程序優(yōu)化選擇是極有必要的.本試驗利用單因素試驗方法對大明竹屬部分植物的反應體系進行了優(yōu)化，建立了適合大明竹屬植物的PCR反應體系及擴增程序，并篩選了18條對大明竹屬植物有效的引物，旨在為大明竹屬植物的遺傳多樣性及鑒定分類等方面研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 選取栽植于福建農林大學百竹園大明竹屬25個竹種(表1)的嫩葉，每個品種取3－5株，用冰壺及變色硅膠迅速干燥，并在－80℃的低溫下保存，以備提取DNA.

表1 大明竹屬25個竹種的情況Table 1 The 25 species of Pleioblastus in the present study

1.1.2 儀器 主要儀器有LabCycler PCR儀、DYY-8C電泳儀、DYCP-31DN電泳槽、JS-680全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀等.

1.1.3 試劑 10 × PCR Buffer、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶、DNA Ladder Marker、dNTPs Mixture、MgCl2、100條隨機引物(哥倫比亞大學公布)、瓊脂糖等購于上海生工生物工程技術服務有限公司;核酸染料Gold View購于上海賽百盛公司;液氮購于福州市第二化工廠;硼酸、無水乙醇、溴酚藍、三羥基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖均為國產分析純.

1.2 基因組DNA的提取

大明竹屬植物基因組DNA采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Cat#BSCl3S1)提?。?6－17］，所提取的DNA的完整性、濃度、純度經電泳及紫外分光光度計測定，滿足試驗要求，并保存于－20℃的冰箱中供ISSR分析.

1.3 ISSR反應體系及擴增程序的建立及優(yōu)化

1.3.1 ISSR-PCR原初體系及擴增程序的建立 參考孫志娟等［18］的方法，將PCR反應體積設定為20 μL，含 40 ng 模板 DNA、0.5 μmol·L－1引物、0.5 mmol·L－1dNTPs、2 μL 10 × PCR Buffer、1.0 U Taq DNA 聚合酶、2.0 mmol·L－1Mg2+.篩選時所應用的擴增程序固定為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

1.3.2 ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化 以大明竹屬25個竹種的DNA樣品為模板，利用UBC811引物在Lab-Cycler PCR儀上篩選ISSR擴增體系.以建立的ISSR-PCR原初體系為基礎，設計不同濃度(用量)的Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs、模板DNA(表2)，每次擴增改變其中的某一因子，研究此因子對ISSR擴增反應的影響，確定各因子濃度(用量)并綜合檢驗體系的擴增效果.

表2 ISSR擴增體系篩選1)Table 2 Design of optimal ISSR reaction system

1.4 ISSR有效引物的篩選及反應體系的檢驗

用100條隨機引物對任意一份DNA樣品進行PCR擴增，在已優(yōu)化的反應體系及擴增程序下進行.對擴增產物進行電泳，并于凝膠成像分析儀上觀察拍照，篩選有效的ISSR引物.有效引物需符合如下條件:(1)條帶清晰，不模糊，不彌散;(2)空白中無或少假帶;(3)對所有樣品均有質量好的條帶.以大明竹屬25個竹種提取的DNA作為模版，用篩選過的ISSR引物在已優(yōu)化的反應體系及擴增程序下進行PCR擴增，檢驗其效果及重復性.

1.5 ISSR有效引物退火溫度的確定

對篩選過的隨機引物，依據Tm=2×(A+T)－4×(C+G)確定引物的理論退火溫度.式中，Tm表示DNA的溶解溫度，A表示腺嘌呤個數(shù)，T表示胸腺嘧啶個數(shù)，C表示胞嘧啶個數(shù)，G表示鳥嘌呤個數(shù).在比引物Tm低5℃的基礎上，設置6個退火溫度梯度，在已優(yōu)化的反應體系及擴增程序下進行PCR擴增，確定引物的最佳退火溫度.

2 結果與分析

2.1 ISSR反應體系的建立

2.1.1 擴增程序的優(yōu)化 PCR擴增程序分為變性、復性和延伸3個階段，對擴增時間、溫度及循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化.不同物種的變性和延伸溫度一般差別不大，變性溫度為94－95℃，延伸溫度為72℃;復性溫度是影響特異性的重要因子;循環(huán)次數(shù)對擴增量也有影響，一般在35－40個循環(huán).經過UBC811引物的初步篩選，在原擴增程序的基礎上確定大明竹屬植物的擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性60 s，55℃復性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

2.1.2 Mg2+濃度的確定 Mg2+是Taq DNA聚合酶維持活性的重要因素.Mg2+濃度不但對酶活性和忠實性有影響，還影響產物的特異性、產物與模板的解鏈溫度、引物退火、引物二聚體形成等.若Mg2+濃度過高會增加非特異性擴增產物，使條帶模糊;若Mg2+濃度過低則Taq DNA聚合酶的擴增效率較低，擴增產物就少.從圖1可以看出:Mg2+濃度為2.0和2.5 mmol·L－1時可擴增出較清晰的條帶，其中以2.5 mmol·L－1擴增的條帶多態(tài)性和亮度最好;當Mg2+濃度大于或小于2.5 mmol·L－1時，條帶的多態(tài)性和清晰度均較差.可見，Mg2+濃度對擴增結果有較大的影響，對PCR擴增極為重要.

2.1.3 Taq DNA聚合酶用量的確定 Taq DNA聚合酶的作用是將dNTPs添加到雙鏈DNA引物鏈上，使聚合形成新DNA鏈.Taq DNA聚合酶的用量由酶活性、反應體積、酶耐熱性等因素決定.若Taq DNA聚合酶用量過高，容易造成非特異性擴增［1］，過低則造成擴增產物少.從圖2可以看出，Taq DNA聚合酶用量低于1.0 U時，其擴增強度弱，而0.5 U的用量則沒有擴增結果.這可能是由于Mg2+濃度固定時，Taq DNA聚合酶的減少會使Mg2+對酶的激活能力相對減弱，導致擴增量下降.當Taq DNA聚合酶用量為1.0 U時，擴增條帶最多;當用量大于1.0 U時，條帶變少，造成了非特異性擴增.可見，Taq DNA聚合酶的用量以1.0 U為宜.

圖1 Mg2+濃度對ISSR擴增的影響Fig.1 The effect of concentration of Mg2+on the amplification of ISSR

圖2 Taq DNA聚合酶用量對ISSR擴增的影響Fig.2 The effect of concentration of Taq DNA polymerases on the amplification of lSSR

2.1.4 dNTPs濃度的確定 dNTPs是PCR擴增的底物，dNTPs濃度對擴增條帶的數(shù)量及亮度存在較大影響.dNTPs濃度過低會導致引物與底物的酶促反應速度下降，擴增量減少;dNTPs濃度過高，一方面會與Mg2+發(fā)生鰲合，使Mg2+濃度降低，從而影響Taq DNA聚合酶的活性，另一方面會導致堿基錯配，降低產物的特異性.因此，確定dNTPs的濃度是非常重要的.圖3表明:dNTPs濃度為0.15 mmol·L－1時，擴增條帶清晰且?guī)?shù)多，效果最好;濃度高于0.15 mmol·L－1時，擴增條帶則變淺，部分條帶消失，這可能是由于抑制了Taq DNA聚合酶的活性從而影響了擴增效果;濃度低于0.15 mmol·L－1時，擴增條帶數(shù)變少，且呈彌散狀，這可能是由于Mg2+不能有效激活Taq DNA聚合酶，導致擴增量減少.可見，dNTPs濃度以0.15 mmol·L－1為宜.

2.1.5 引物濃度的確定 引物濃度偏高時容易導致引物之間形成二聚體，還容易引起非特異性擴增及錯配，同時引物之間會產生競爭，使擴增量大幅下降;引物濃度過低時，引物與模板DNA結合的機率降低，反應提前結束，使擴增條帶變淺甚至沒有條帶.圖4表明:引物濃度為0.1和0.2 μmol·L－1時，沒有出現(xiàn)擴增條帶;濃度為 0.3 和 0.4 μmol·L－1時出現(xiàn)不清晰條帶;當濃度大于 0.5 μmol·L－1時，條帶很亮但背景模糊，這可能由非特異性擴增導致.經綜合考慮，引物濃度以0.5 μmol·L－1為宜.

圖3 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響Fig.3 The effect of concentration of dNTP on the amplification of lSSR

圖4 引物濃度對ISSR擴增的影響Fig.4 The effect of concentration of primer on the amplification of lSSR

2.1.6 模板DNA用量的確定 PCR擴增對模板DNA用量及純度的要求不高，僅2個拷貝模板或細胞粗提物即可進行PCR擴增.但為了確保擴增效率及特異性，仍需一定量的模板DNA，以避免交叉污染導致反應失敗.圖5表明，模板DNA用量為10－100 ng時，條帶的清晰度相似，表明模板DNA用量對擴增效果的影響較小，較大范圍的用量均能擴增出清晰條帶.但當模板DNA用量不足時，會降低擴增效率，引物與模板有效配對較難;若模板DNA用量太大，引物耗盡過早，會造成退火發(fā)生在PCR產物3'端與模板間或產物間，導致延伸中止，條帶呈彌散狀.根據圖5中條帶的清晰度，模板DNA用量以50 ng為宜.

圖5 模板DNA用量對ISSR擴增影響Fig.5 The effect of concentration of DNA template on the amplification of lSSR

2.1.7 ISSR-PCR反應體系各因子的終濃度(用量) 采用單因素試驗方法，對影響PCR擴增的5個因子進行優(yōu)化并檢驗，最終確立大明竹屬植物 20 μL 反應體系含 50 ng模板 DNA、0.5 μmol·L－1引物、0.15 mmol·L－1dNTPs、2 μL 10 × PCR Buffer、1.0 U Taq DNA 聚合酶、2.5 mmol·L－1Mg2+.

2.2 有效引物的篩選

利用已優(yōu)化的大明竹屬植物ISSR-PCR反應體系及擴增程序，對選取的100條隨機引物進行篩選(圖6)，最終篩選出18條條帶清晰、多態(tài)性豐富且重復性高的有效引物(表3).

圖6 大明竹屬植物部分引物的ISSR擴增電泳圖譜Fig.6 Electrophoretogram of ISSR amplification of some primers in Pleioblastus

2.3 退火溫度的確定

退火溫度會影響擴增條帶的帶譜，與引物及物種的序列相關［19］.退火溫度一般設定比引物的理論退火溫度低5℃，然后以2℃的幅度逐級增大.退火溫度較高時會影響引物二聚體和非特異性產物的形成，可在設定的較高退火溫度下先進行5個循環(huán)，再在較低的溫度下進行余下循環(huán)來提高產物的特異性.ISSR引物對退火溫度的要求嚴格，每一條引物的退火溫度不盡相同.退火溫度越高，產物的特異性就越高，但擴增量就會減少;反之，溫度越低，則擴增量越高，但容易引起引物與模板錯配.根據上述規(guī)律，確定已篩選的18條ISSR引物的最適退火溫度為49.2－55.2℃(表3).

2.4 ISSR有效引物及優(yōu)化體系的檢驗

以大明竹屬25個竹種的DNA為模版，用篩選過的ISSR引物在已優(yōu)化的反應體系及擴增程序下進行PCR擴增，擴增條帶清晰度高、多態(tài)性豐富、重復性高(圖7).

表3 大明竹屬植物的ISSR有效引物Table 3 The sequence of ISSR primers in Pleioblastus

圖7 引物UBC840對大明竹屬植物的ISSR擴增電泳圖譜Fig.7 The electrophoretogram of ISSR amplification by primer UBC840 for Pleioblastus

3 討論與結論

影響PCR擴增的因素很多，有效性、特異性及忠實性為檢驗擴增效果的指標，但高特異性的影響因子可能與高擴增量的影響因子存在差異，因此在建立PCR反應體系時，需要確定哪些參數(shù)指標最重要，并據此優(yōu)化反應條件.在PCR反應體系的建立及優(yōu)化中，單因素試驗方法得到了廣泛的應用［20－21］，但因單因素試驗沒有考慮各因子的交互作用，因此略有缺陷.正交試驗恰好能彌補此缺陷，這種方法已逐漸在該領域應用［22－24］.正交試驗雖然可確定各因子影響的主次關系，但其對技術要求高，加樣時間較長，可能易引起模板斷裂或Taq DNA聚合酶失活，影響擴增結果.本試驗在前人研究的基礎上，以大明竹屬25個竹種的DNA為模板，UBC811為引物，采用單因素試驗方法，先對反應體系及擴增程序進行優(yōu)化，確定各因子濃度(用量)后進行擴增檢驗;在已優(yōu)化反應體系及擴增程序的基礎上，對有效引物進行篩選，并確定引物的退火溫度;以大明竹屬25個竹種的DNA為模版，用18條ISSR引物在已優(yōu)化的反應體系及擴增程序下進行擴增.

本試驗采用單因素試驗方法，對影響大明竹屬植物PCR反應的各因子及擴增程序進行了優(yōu)化，建立了ISSR反應體系，并從初選的100條引物中篩選出18條條帶清晰、多態(tài)性好、重復性高的有效引物，為ISSR分析大明竹屬植物的遺傳多樣性及遺傳結構提供參考.優(yōu)化后的大明竹屬植物ISSR-PCR的20 μL反應體系含 2.0 μL 10 × PCR Buffer、2.5 mmol·L－1Mg2+、0.15 mmol·L－1dNTPs、0.5 μmol·L－1引物、1.0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板DNA、10.6 μL滅菌ddH2O.擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性60 s，55℃復性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

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