一株聚己內(nèi)酯降解真菌的篩選、鑒定及降解特性研究

陳 珊，林秀梅，李 凡，劉東波，夏紅梅

(東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024)

0 引言

從上世紀(jì)60年代開始，塑料以其質(zhì)輕、價廉、易加工成型等優(yōu)勢受到了人們的青睞，與鋼鐵、木材、水泥并列成為材料領(lǐng)域的四大支柱，被應(yīng)用于社會生活的各個方面。但是傳統(tǒng)塑料固有的不可降解性使其在環(huán)境中大量堆積，已經(jīng)對地球造成了嚴(yán)重的污染和巨大的威脅[1]。近年來，為了解決環(huán)境危機問題，可生物降解材料及相關(guān)研究受到了關(guān)注，聚羥基丁酸酯(PHB)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚琥珀酸丁酸酯(PBS)等高分子聚合物作為可生物降解材料已經(jīng)被成功地應(yīng)用于包裝、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及其它領(lǐng)域。PCL由ε-己內(nèi)酯在金屬有機化合物(如四苯基錫)做催化劑，二羥基或三羥基做引發(fā)劑條件下開環(huán)聚合而成，屬于聚合型聚酯。它具有較好的生物相容性、生物降解性、溶劑溶解性，以及高結(jié)晶性和低熔點性，這些優(yōu)良的性質(zhì)使PCL可以成為傳統(tǒng)塑料的有效替代物；另外該聚合物安全無毒，在生物醫(yī)用材料、環(huán)境友好型塑料、生態(tài)纖維等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[2]。

據(jù)報道，PCL在微生物的作用下可被完全分解成CO2和H2O，在自然條件下，該材料一年可降解約95%[3]。研究發(fā)現(xiàn)一些降解脂肪或角質(zhì)的微生物對PCL具有降解作用[4]，也證明了這種作用是由微生物分泌的PCL解聚酶引起的，但具體的降解機制尚未闡明。本文從土壤中篩選出的一株可降解PCL的真菌DSYD05，并對該菌株進行了菌種鑒定及降解特性的研究，為進一步研究PCL的微生物降解機理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1)菌株的篩選。采集多地活性污泥，打散后的上清液進行梯度稀釋，涂布于以PCL為唯一碳源的平板上28℃恒溫培養(yǎng)，選取菌落周圍有明顯透明圈的菌株進行進一步的研究。

2)培養(yǎng)基(W/V)。察氏培養(yǎng)基：NaNO3，0.3%；KH2PO4，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；KCl，0.05%；FeSO4，0.001%；蔗糖，3%；瓊脂，1%；自然pH。PCL乳化培養(yǎng)基：PCL，0.1%；Na2HPO4·12H2O，1.194%；KH2PO4，0.554%；NH4Cl，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；CaCl2·2H2O，0.0005%；pH為6.8。

3)PCL乳化液的制備。將0.1g PCL顆粒溶于10mL氯仿中，加入0.04g Plysurf A210G乳化液攪拌均勻后與100mL培養(yǎng)基或緩沖液混合，超聲破碎約10min，將所得懸浮液75℃處理90min去除氯仿，用蒸餾水定容至100mL。

4)粗酶液的制備。將孢子懸液接入PCL乳化培養(yǎng)基中，一定條件下培養(yǎng)，將發(fā)酵液于4℃，12,000rpm離心20min，所獲得上清液為粗酶液。

5)酶活力的測定。用磷酸緩沖液(pH 6.0)制備PCL乳化液作為酶活力檢測的底物。取3mLPCL乳化液置于40℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱10min后，加入1mL粗酶液，保溫一定時間后，測定650nm處光吸收值(降低值)，以滅活的粗酶液作空白對照。一個酶活單位定義為：每分鐘引起光吸收值降低 0.001(A650nm)單位所需的酶量[5]。

6)菌株的形態(tài)學(xué)鑒定。通過插片培養(yǎng)法、點植培養(yǎng)法觀察菌落形態(tài)，在顯微鏡下觀察菌絲體大小、形狀、表面特征及是否有橫隔、類型、顏色、形狀、孢子大小等，對照《真菌鑒定手冊》[6]進行初步判斷。

7)菌株的分子生物學(xué)鑒定及進化分析。以菌株基因組DNA為模板進行ITS序列擴增及分析，基因組DNA提取方法參考分子生物學(xué)實驗方法[7]。所用擴增引物為正向引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，反向引物ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃終延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，連接至PMD18-T載體送上海生工公司測序。將測得的基因序列進行NCBI Blast分析，并采用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

8)發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。將孢子懸液接入到PCL乳化液培養(yǎng)基中，分別置于20℃、25℃、28℃、37℃和42℃搖床中培養(yǎng)。間隔24h取樣，測定粗酶液的PCL降解活力，研究不同發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)PCL解聚酶的影響。

9)PCL含量對菌株產(chǎn)酶的影響。配制PCL含量分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%的乳化培養(yǎng)基，接種后在測得的最適發(fā)酵溫度下培養(yǎng)。間隔24h取樣，測定粗酶液的PCL降解活力，研究不同PCL含量對菌株產(chǎn)PCL解聚酶的影響。

10)培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響。制備最適含碳量的PCL乳化培養(yǎng)基，初始pH值分別調(diào)至5、6、7、8和9，接種后在測得的最適發(fā)酵溫度下培養(yǎng)。間隔24h取樣，測定粗酶液的PCL降解活力，研究培養(yǎng)基不同初始pH對菌株產(chǎn)PCL解聚酶的影響。

11)裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響。將PCL乳化液培養(yǎng)基分別按裝液量為25、50、75、100和125mL分裝至250mL的三角瓶中，接種后置于最適發(fā)酵溫度下培養(yǎng)。間隔24h取樣，測定粗酶液的PCL降解活力，研究不同通氣量對菌株產(chǎn)PCL解聚酶的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選

采用透明圈法從多個土樣中成功篩選到5株可降解PCL的真菌，對這5株真菌進行液體培養(yǎng)后，依次測定了各菌株降解PCL的能力，其中菌株DSYD05具有最高的PCL降解能力，因此選擇該菌株進行進一步的研究。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株DSYD05在28℃培養(yǎng)3d后，菌落直徑約為36mm，氣生菌絲為絮狀，緊貼培養(yǎng)基生長，菌落生長致密，表面平坦，邊緣光滑整齊，具有霉味。菌落最外緣為白色，向中心依次呈綠色、墨綠色、灰綠色，灰綠色為分生孢子(圖1)。背面顏色由外向內(nèi)從白色逐漸變成暗黃色(圖2)。

顯微鏡下觀察可見氣生菌絲呈絨狀，顯白色，一般較長，具有橫隔，壁光滑(圖3)。分生孢子梗為帚狀枝，對稱或不對稱分支。瓶梗為柱形細胞。分生孢子多，呈灰綠色，橢圓形，壁光滑，分生孢子鏈糾纏在一起，分生孢子數(shù)一至多個不等(圖4)。

圖1 菌落正面生長狀況 圖2 菌落背面生長狀況

圖3 菌株DSYD05菌絲體形態(tài) 圖4 菌株DSYD05的帚狀枝結(jié)構(gòu)

根據(jù)菌株的菌落特征及菌絲體和孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》，認為該菌株屬于半知菌亞門Deuteromycotina，絲孢真菌綱Hyphomycetes，絲孢菌目Hyphomycetales，叢梗孢科Moniliaceae，青霉屬Penicillium。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

在形態(tài)學(xué)觀察的同時對菌株進行了分子生物學(xué)鑒定。測定該菌株的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源序列比對。比對結(jié)果與青霉屬的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的序列一致度為100﹪。將相關(guān)序列通過Clustal X軟件進行多序列比對之后，利用軟件MEGA4.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。菌株DSYD05在系統(tǒng)樹中與Penicilliumoxalicum屬于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為青霉屬Penicilliumsp.的草酸青霉Penicilliumoxalicum。

2.3 Penicillium oxalicum DSYD05降解特性的研究

2.3.1 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將孢子懸液接種到PCL乳化液培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度下震蕩培養(yǎng)，繪制Penicillium oxalicum DSYD05在不同發(fā)酵溫度條件下的產(chǎn)酶曲線，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，在不同溫度下培養(yǎng)，菌株的產(chǎn)酶曲線隨培養(yǎng)時間的延長均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。由于菌株在不同溫度下的生長狀態(tài)不同，因此其達到產(chǎn)酶高峰的時間也不相同， 28℃時菌株產(chǎn)酶酶活力達到最高，隨著溫度的繼續(xù)升高，不利于菌株的生長及產(chǎn)酶，到達產(chǎn)酶高峰時間有所延長，酶活力開始下降。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05菌株產(chǎn)PCL解聚酶的最適發(fā)酵溫度為28℃。

圖5 DSYD05菌株ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6不同培養(yǎng)溫度下PenicilliumoxalicumDSYD05的產(chǎn)酶曲線

2.3.2 PCL含量對菌株產(chǎn)酶的影響

將孢子懸液分別接種到PCL含量(w/v)分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%的乳化液培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)，繪制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同PCL含量條件下的產(chǎn)酶曲線(圖7)。由圖可知，在各PCL含量下菌株產(chǎn)酶

示Lh學(xué)產(chǎn)酶 高峰均出現(xiàn)在第5天，培養(yǎng)基中PCL含量為0.2%時，PenicilliumoxalicumDSYD05產(chǎn)PCL解聚酶的量最大，低于或高于該濃度，粗酶液的PCL解聚酶活力均出現(xiàn)下降。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05菌株產(chǎn)PCL解聚酶的最適培養(yǎng)基碳源含量為0.2%。

2.3.3 發(fā)酵初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

制備PCL含量為0.2%的乳化培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH分別為5、6、7、8和9，接入孢子懸液后于28℃下震蕩培養(yǎng)，繪制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同初始發(fā)酵pH條件下的產(chǎn)酶曲線(圖8)。由圖可知，初始發(fā)酵pH對菌株產(chǎn)酶影響明顯，在5-7范圍內(nèi)，隨著初始pH的升高，PCL解聚酶活力增強，pH為7時，DSYD05產(chǎn)PCL解聚酶活力達到最大，隨著pH的繼續(xù)增大，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)滯后，酶活力降低，可能是由于菌株要適應(yīng)不良環(huán)境而導(dǎo)致生長相對緩慢。在以往報道中，真菌的最適生長和產(chǎn)酶pH一般為中性偏酸，但在本實驗中培養(yǎng)基初始pH為中性時，菌株DSYD05產(chǎn)酶最好，同時在初始發(fā)酵pH為偏堿性時菌種仍然具有較好的產(chǎn)酶能力，這可能是因為PCL在降解的過程中會生成酸性的中間產(chǎn)物，造成培養(yǎng)基pH的降低，因此初始的發(fā)酵pH稍高更適合菌株的后續(xù)生長和產(chǎn)酶。由此實驗結(jié)果可以得出PenicilliumoxalicumDSYD05菌株產(chǎn)PCL解聚酶的最適發(fā)酵初始pH為7。

2.3.4 不同裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

制備PCL含量為0.2%的乳化培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH為7，分別按裝液量為25、50、75、100、125mL分裝至250mL的三角瓶中，接入孢子懸液后于28℃下震蕩培養(yǎng)，繪制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同裝液量條件下的產(chǎn)酶曲線，結(jié)果如圖9所示。由圖可知，當(dāng)裝液量為25mL時，搖瓶的通氣量最好，適宜菌體的生長，使PenicilliumoxalicumDSYD05的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)較早(第4d)，但此時的酶活力并不是最高，可能與營養(yǎng)物質(zhì)有限限制了菌體的生長和產(chǎn)酶有關(guān)。隨著裝液量的增加，菌株到達產(chǎn)酶高峰時間有所延長，當(dāng)裝液量為50mL時，菌株產(chǎn)酶酶活力達到最高，繼續(xù)增加裝液量時，發(fā)酵體系中的溶氧量也隨之下降，不利于菌株的生長，酶活力也呈下降趨。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05產(chǎn)PCL解聚酶的最適裝液量為50mL。

3 結(jié)語

本文采用唯一碳源法從活性污泥中篩選了一株對PCL具有降解活性的真菌，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析，鑒定該菌株為草酸青霉Penicillium oxalicum。采用搖床液體培養(yǎng)的方法，對Penicillium oxalicum DSYD05產(chǎn)PCL解聚酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化研究，實驗結(jié)果顯示，在28℃、PCL含量0.2%、培養(yǎng)基初始pH值為7、裝液量50mL，培養(yǎng)5d時Penicillium oxalicum DSYD05產(chǎn)PCL解聚酶量可達到最高值。在各條件中，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值對菌株的產(chǎn)酶量影響較大。為了進一步研究菌株對PCL的微生物降解機制，下一步工作將該對菌株產(chǎn)生的PCL解聚酶進行分離純化和催化特性的研究。

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