白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物促進皮膚纖維芽細胞的膠原蛋白合成

安 家 彥, 王 東 明, 劉 春 瑩, 曹 體 爽, 王 偉, 正 木 仁, 魚 紅 閃, 金 鳳 燮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.日本日光化學(xué)(株)化妝品技術(shù)研究中心, 東京都 )

0 引 言

白頭翁為毛茛科植物白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.) Regel的干燥根,為常用中藥,具有清熱解毒、涼血止痢功效。白頭翁皂苷是重要的活性成分之一,質(zhì)量分數(shù)占白頭翁的8%～10%,皂苷中80%以上是5個糖基的皂苷[1],其中以白頭翁皂苷B4的含量最高,藥典規(guī)定其質(zhì)量分數(shù)不低于4.6%[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白頭翁皂苷具有抗腫瘤、抗菌、抗血管舒張等作用[4-5]。天然存在的白頭翁皂苷大多含有5個糖基,難以被人體吸收利用,并具有一定的溶血性[1],而低糖基的皂苷則易于被人體吸收。皮膚纖維芽細胞中膠原蛋白含量的高低,對肌膚的光澤、彈性、老化具有重要影響。年輕人的真皮中,膠原蛋白含量很高,一般在90%以上。隨著年齡的增長,其含量逐漸降低；另外,在外界環(huán)境中,例如紫外線等對皮膚內(nèi)膠原蛋白的合成也有阻礙作用[6]。維生素A或維生素A酸衍生物作為添加劑添加在化妝品中[7],具有一定的促進膠原蛋白合成的作用,但對皮膚有一定的副作用；另外一些效果較好的抗皮膚老化添加劑,雖然副作用低,但是因為價格昂貴而難以普及。因此,找到一種能促進皮膚中膠原蛋白的合成、抗老化效果較好而價格較低的添加劑,對化妝品行業(yè)具有重要意義[8]。

本實驗室前期從微生物中篩選出白頭翁皂苷酶,在體外對多糖基的白頭翁皂苷進行水解,制備了低糖基的白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物[9-10],其中主要成分是白頭翁皂苷元、1糖基白頭翁皂苷和2糖基白頭翁皂苷,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。為了得到廉價的皮膚抗老化化妝品的添加劑,作者研究了白頭翁皂苷的酶解產(chǎn)物對皮膚纖維芽細胞的膠原蛋白合成的影響。

Glc,葡萄糖基；Ara,阿拉伯糖基

1 實 驗

1.1 材料和儀器

白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物,本實驗室提供；測定膠原蛋白的蘇米龍H 型多孔試劑盒,日本住友公司；皮膚纖維芽細胞I型,日本日光化學(xué)有限公司。

1.2 方 法

為了檢測白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物對纖維芽細胞膠原蛋白合成的影響,用蘇米龍H型多孔試劑盒進行免疫抗體法(ELISA)檢測。

以含有5%小牛血清(FBS)的DMEM作為培養(yǎng)基,首先將纖維芽細胞接種于此培養(yǎng)基上,分放于96孔板中。在培養(yǎng)24 h以后,換成含有低糖基白頭翁皂苷樣品的5% FBS的DMEM溶液,再培養(yǎng)48 h后測定細胞中膠原蛋白與總蛋白的質(zhì)量。

總蛋白量的檢測:先用0.1%的Triton X-100溶液將細胞破碎溶解,然后采用Lowry法[11]測定蛋白含量。膠原蛋白的質(zhì)量用ELISA抗體法測定,并繪制膠原蛋白的標準曲線。將上清液與蘇米龍H型多孔試劑盒試劑混合,于4 ℃過夜,然后加入1%的小牛血清蛋白(BSA)溶液,37 ℃下保持1 h,再加入0.3%的BSA溶液、稀釋100倍的PO(兔)抗體,在37 ℃反應(yīng)1 h,最后用0.3 mg/mL 的2,2-偶氮(3-乙基聯(lián)苯胺-6-磺酸)二胺鹽[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzoline-6-sulfonic acid) diammouium salt (ABTS)](溶解于0.1 mol/L pH 4.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)反應(yīng)20 min,測定波長405 nm的吸光值。

培養(yǎng)基中的ELISA所測定膠原蛋白的質(zhì)量,通過與相同96孔板所測得的標準曲線作對照查得。膠原蛋白合成量計算公式:

膠原蛋白合成量(ng/mg)=ELISA所測定膠原蛋白量(ng/孔)÷Lowry法測得的總蛋白量(mg/孔)。

膠原蛋白合成能力的測定:將沒有添加樣品進行培養(yǎng)的細胞合成膠原蛋白的能力作為100%,含有不同濃度低糖基白頭翁皂苷樣品培養(yǎng)的細胞膠原蛋白合成量以“%”來表示。膠原蛋白合成情況的實驗結(jié)果用Student T法進行誤差處理并評估效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物對膠原蛋白合成的影響

從表1可以看出,添加白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物(低糖基白頭翁皂苷)后,膠原蛋白合成量每個孔增加8～19 ng/μg。

表1 白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物促進膠原蛋白生成的量(n=6)

Tab.1 Quantity of collagen improved by hydrolysates of pulsatilla saponins

通過表1計算得到的白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物促進纖維芽細胞I型膠原蛋白合成能力,結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知,添加0.1 μg/mL白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物后,膠原蛋白的合成能力提高了24%左右；添加物增大到1.0 μg/mL后,膠原蛋白的合成能力沒有再次明顯提高,僅提高了21%左右；添加物增大到10.0 μg/mL,膠原蛋白的合成能力明顯提高了51%左右。以上結(jié)果說明,添加白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物后,膠原蛋白的量與沒有添加的情況相比有了明顯的增加。

表2 白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物對纖維芽細胞Ⅰ型膠原蛋白合成的促進作用(n=6)

Tab.2 Promoting effect of hydrolysates of pulsatilla saponins on synthesis of Ⅰ type collagen

2.2 白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物應(yīng)用于化妝品的試驗結(jié)果

為了了解白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物可以應(yīng)用于化妝品的可能性,將其與常用的化妝品添加劑混合配制成化妝品,以20～30歲男女各10人作為受試者進行人體皮膚搽試試驗?；瘖y品主要成分見表3。

表3 含白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物化妝品的主要成分

Tab.3 Composition of cosmetic containing hydrolysates of pulsatilla saponins

化妝品配方中主要還有丙烯酸酯、黃原膠、1,3-丁二醇、透明質(zhì)酸鈉、精制水、精氨酸等成分。將化妝品在人體手臂上進行搽試,每天2次,試用2周后并未出現(xiàn)不良反應(yīng),說明白頭翁皂苷的酶解產(chǎn)物可以應(yīng)用于抗皮膚老化的化妝品。

3 結(jié) 論

白頭翁皂苷的酶解產(chǎn)物對纖維芽細胞的膠原蛋白的合成具有促進作用,添加了白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物的化妝品沒有副作用。因此,白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物可以應(yīng)用于抗皮膚老化的化妝品。

[1] 金鳳燮. 天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2009:123.

[2] 國家藥典編委會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:96.

[3] 王偉,李紅捷,魚紅閃,等. 白頭翁皂苷及次生物的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(28):8779-8780.

[4] XU Q M, SHU Z, HE W J, et al. Antitumor activity of Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo.[J]. Phytomedicine, 2012, 19:293-300.

[5] 劉顯軍,陳靜,尚麗娟. 白頭翁皂苷的提取及抑菌活性試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2012, 48(1):69-70.

[6] 駱丹,許陽. 皮膚光老化的診治進展[J]. 皮膚病與性病, 2012, 34(1):20-24.

[7] 張良芬. 外用維生素A 在皮膚科的重新應(yīng)用[J]. 國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊, 2001, 27(5):301-302.

[8] 王昱琳. 膠原蛋白在化妝品中的應(yīng)用研究進展[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2012, 32(1):8-12.

[9] 王偉,唐正軍,魚紅閃,等. 白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物的分離純化[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2005, 24(1):4-7.

(WANG Wei, TANG Zhengjun, YU Hongshan, et al. Seperation and purification of pulsatilla saponin products by gradient elution and enzyme hydrolysis[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2005, 24(1):4-7.)

[10] 張小愚,王偉,劉琳,等. 單糖基白頭翁皂苷的分離純化[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2006, 25(2):79-82.

(ZHANG Xiaoyu, WANG Wei, LIU Lin, et al. Separation and purification of monosaccharide pulsatilla saponin[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2):79-82.)

[11] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193:265-275.