乳酸菌發(fā)酵蟹殼脫鈣的菌株篩選及條件優(yōu)化

張建平，曹海龍*，趙 勇，李曙光，岳 敏，劉 航，尹 恒，杜昱光

（1.中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

幾丁質(zhì)俗稱甲殼素，又名殼多糖、聚乙酰氨基葡萄糖、甲殼質(zhì)等，是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接的一種天然高分子多糖，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼動(dòng)物的外殼、軟體動(dòng)物的器官、以及細(xì)菌、真菌和植物的細(xì)胞壁中。在自然界中，幾丁質(zhì)作為一種天然高分子多糖，其蘊(yùn)藏量及年產(chǎn)量?jī)H次于纖維素。由于幾丁質(zhì)及其衍生物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保、輕紡和日化等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，因此催生出了一個(gè)開(kāi)發(fā)利用幾丁質(zhì)及其相關(guān)產(chǎn)品的巨大產(chǎn)業(yè)[1-3]。

目前，國(guó)內(nèi)外主要以蝦蟹殼為原料，采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿來(lái)分別脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣和蛋白的傳統(tǒng)方法生產(chǎn)幾丁質(zhì)。此過(guò)程由于消耗大量的酸堿，往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，嚴(yán)重制約了幾丁質(zhì)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此開(kāi)發(fā)出綠色清潔的幾丁質(zhì)生產(chǎn)工藝對(duì)幾丁質(zhì)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要[4]。

研究表明，采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸來(lái)脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣是一種行之有效的替代方法，是目前幾丁質(zhì)綠色清潔生產(chǎn)工藝研究的熱點(diǎn)。由于乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸[5]與蝦蟹殼中的碳酸鈣反應(yīng)產(chǎn)生可溶的乳酸鈣，且還可通過(guò)菌體產(chǎn)生蛋白酶脫除蝦蟹殼中的蛋白，使得這種方法不但對(duì)環(huán)境造成的污染小，而且還能在幾丁質(zhì)的生產(chǎn)過(guò)程中回收大量的有機(jī)鈣、蛋白和一定的色素[6]。目前，在國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道中，利用生物發(fā)酵法進(jìn)行蝦蟹殼脫鈣研究所采用的微生物菌株主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等[4，7-8]，且大多數(shù)研究以蝦殼原料為主，僅有少數(shù)研究采用蟹殼為原料。

基于乳酸菌具有較好的生物發(fā)酵脫鈣能力，本文對(duì)15株乳酸菌菌株進(jìn)行了發(fā)酵蟹殼脫鈣的初步考察，并對(duì)篩選出的具有較高發(fā)酵蟹殼脫鈣能力的菌株進(jìn)行了接種量、糖濃度和發(fā)酵時(shí)間等單因素的實(shí)驗(yàn)，以期為該菌株發(fā)酵蟹殼脫鈣的進(jìn)一步研究和工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

見(jiàn)表1，其中菌株6032來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），其余來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。

表1 乳酸菌菌株信息Table 1 The information of lactic acid bacteria

1.1.2 原料

蟹殼，由大連中科格萊克生物科技有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，葡萄糖20.0g，吐溫-80 1mL，用去離子水定容至1L，調(diào)pH為6.5；固體培養(yǎng)基需添加2%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，葡萄糖0～125g，蟹殼50g～300g，用去離子水定容至1L。

1.1.4 主要儀器

箱式電阻爐購(gòu)自山東省龍口市先科儀器有限公司，QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自太倉(cāng)市華美生化儀器廠，DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司，電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與種子培養(yǎng)

將保存于-80℃的乳酸菌劃線于新配制的MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為2d。之后再將菌體劃線轉(zhuǎn)接于新固體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2d。取活化好的菌株，接種1環(huán)至30mL MRS液體培養(yǎng)基（100mL錐形瓶），于30℃振蕩培養(yǎng)箱中150r/min培養(yǎng)20h作為種子備用。

1.2.2 原料預(yù)處理

蟹殼經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩，取大于40目部分（0.6mm～4mm）于105℃干燥5h備用。

1.2.3 菌株的篩選

將15株乳酸菌種子液分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（100mL·250mL-1錐形瓶）中，接種量為10%（種子培養(yǎng)基OD600值達(dá)到4～5），于30℃振蕩培養(yǎng)箱150r/min培養(yǎng)7d。發(fā)酵結(jié)束后，將蟹殼過(guò)60目篩洗凈，于105℃干燥箱中恒溫干燥至恒重，稱重并測(cè)其灰分含量，篩選出脫鈣率最高的菌株。

1.2.4 脫鈣率的測(cè)定方法

采用測(cè)灰分的方法[9]測(cè)定脫鈣率。將發(fā)酵后的蟹殼過(guò)60目篩洗凈，于105℃干燥箱中恒溫干燥至恒重，測(cè)其質(zhì)量記為M1（g）。之后于箱式電阻爐中550℃灼燒3h，測(cè)其灰分含量，記為S1（%）。發(fā)酵處理前蟹殼質(zhì)量M0（g），采用同樣的方法進(jìn)行處理，測(cè)灰分含量為S0（%）。脫鈣率計(jì)算公式如下所示：

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，固定接種量為10%（種子培養(yǎng)基OD600值達(dá)4～5），分別考察發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖濃度和固液比對(duì)脫鈣率的影響，從而確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。發(fā)酵時(shí)間分別取1d、3d、5d和7d。葡萄糖濃度分別采用0g/100mL、2.5g/100mL、5g/100mL、10g/100mL和12.5g/100mL，除葡萄糖之外的條件同發(fā)酵培養(yǎng)基。選取固液比分別為5g/100mL、10g/100mL、20g/100mL和30g/100mL進(jìn)行考察，即在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上只改變蟹殼的添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵蟹殼脫鈣菌株的篩選

采用上述方法中菌株的篩選步驟，對(duì)15株乳酸菌進(jìn)行了考察。所選15株乳酸菌均是根據(jù)以往報(bào)道常用的產(chǎn)乳酸的菌株，根據(jù)脫鈣率的大小篩選出脫鈣效果最好的菌株，結(jié)果如表2所示。

從表2中可以看出，所考察的15株乳酸菌中菌株AS 1.2437對(duì)蟹殼脫鈣效果最好，發(fā)酵7d蟹殼脫鈣率達(dá)到89.17%。因此，選用AS1.2437菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

表2 乳酸菌發(fā)酵蟹殼的脫鈣率比較Table 2 Decalcification ratio of crab shell after fermentation with different lactic acid bacteria

乳酸菌發(fā)酵蟹殼脫鈣的主要影響因素是發(fā)酵時(shí)間、糖濃度、接種量及發(fā)酵過(guò)程中的pH值，所以對(duì)AS 1.2437菌株進(jìn)行了發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖濃度和接種量這三個(gè)因素的考察，指標(biāo)中除了測(cè)定發(fā)酵后的脫鈣率，還對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的pH值進(jìn)行了分析。

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌AS1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟹殼脫鈣率及發(fā)酵液pH值的影響Fig.1 The effect of different fermentation time on pH and the decalcification ratio of crab shell

由圖1，在發(fā)酵前3d，乳酸菌AS 1.2437隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)蟹殼脫鈣率顯著提高，在發(fā)酵第3d，乳酸菌AS 1.2437對(duì)蟹殼脫鈣率達(dá)到81%；發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至第5d，乳酸菌AS 1.2437對(duì)蟹殼脫鈣率相對(duì)發(fā)酵到第3d的脫鈣率提高7.81%，此后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)乳酸菌AS 1.2437對(duì)蟹殼脫鈣效果無(wú)顯著性變化。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的pH進(jìn)行監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前3d發(fā)酵液pH值顯著降低；發(fā)酵第3d至第5d，發(fā)酵液pH值變化趨緩；發(fā)酵第5d后，發(fā)酵液pH值無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明，蟹殼中碳酸鈣的脫除主要受乳酸菌AS 1.2437在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)（如乳酸）的影響較大，而發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌AS 1.2437在代謝過(guò)程中產(chǎn)生酸量多少有關(guān)。綜合考慮到發(fā)酵成本、設(shè)備利用率與脫鈣率等因素，后續(xù)研究中將發(fā)酵時(shí)間設(shè)定在5d。

2.2.2 發(fā)酵液中葡萄糖濃度對(duì)乳酸菌AS 1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖2 糖濃度對(duì)蟹殼脫鈣率及發(fā)酵液pH值的影響Fig.2 The effect of different glucose concentration on pH and the decalcification ratio of crab shell

菌體需要一定的碳源來(lái)生長(zhǎng)繁殖，因此碳源濃度對(duì)于乳酸菌的生長(zhǎng)及有機(jī)酸的產(chǎn)量有明顯的影響。當(dāng)葡萄糖作為乳酸菌生長(zhǎng)的主要碳源時(shí)，乳酸菌通過(guò)同型乳酸發(fā)酵途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。葡萄糖濃度不足將導(dǎo)致乳酸菌可轉(zhuǎn)化的碳源缺乏，限制了乳酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生，從而會(huì)降低乳酸菌對(duì)蟹殼的脫鈣效果；葡糖糖濃度過(guò)高，可能會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝造成抑制效應(yīng)，對(duì)菌體代謝產(chǎn)酸不利，同時(shí)會(huì)造成發(fā)酵成本的增加。由于，葡萄糖濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和有機(jī)酸產(chǎn)生密切相關(guān)。在本研究中，我們考察了發(fā)酵液中葡萄糖濃度對(duì)乳酸菌處理蟹殼脫鈣效果的影響。由圖2所示，在實(shí)驗(yàn)中所考察的發(fā)酵液中葡萄糖濃度范圍，隨著發(fā)酵液中葡萄糖濃度的提高，乳酸菌對(duì)蟹殼脫鈣效果逐漸提高。當(dāng)發(fā)酵液中初始葡萄糖達(dá)到10g/100mL時(shí)，乳酸菌對(duì)蟹殼脫鈣率達(dá)到89.00%。

2.2.3 發(fā)酵液中蟹殼與發(fā)酵液的比例對(duì)乳酸菌AS1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖3 固液比對(duì)蟹殼脫鈣率及發(fā)酵液pH值的影響Fig.3 The effect of different solid-liquid ratio on pH and the decalcification ratio of crab shell

為保證發(fā)酵液能夠充分潤(rùn)濕蟹殼，本實(shí)驗(yàn)采用的蟹殼與發(fā)酵液的比例最高為每100mL發(fā)酵液中含30g蟹殼。如圖3所示，當(dāng)發(fā)酵液中蟹殼與發(fā)酵液的比超過(guò)達(dá)到20g/100mL時(shí)，發(fā)酵液pH值呈堿性，表明乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸較少或被中和。當(dāng)發(fā)酵液中蟹殼與發(fā)酵液的比小于10g/100mL時(shí)，發(fā)酵液pH值呈酸性。從脫鈣率曲線上可以看出，蟹殼在發(fā)酵液中所占比例越小脫鈣率越高，在固液比為5g/100mL時(shí)脫鈣率高達(dá)95.5%。

3 結(jié)論與討論

該研究以工業(yè)化應(yīng)用為出發(fā)點(diǎn)，將15株乳酸菌為出發(fā)菌株，采用與蟹殼共發(fā)酵的方式進(jìn)行了篩選，選出脫鈣效果最好的編號(hào)為AS 1.2437的菌株。該菌株在接種量10%，固液比5g/100mL，糖濃度10g/100mL，發(fā)酵溫度為30℃條件下發(fā)酵5d，脫鈣率高達(dá)95.5%。植物乳桿菌AS 1.2437是發(fā)酵蟹殼脫鈣的優(yōu)良菌株。

在發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，在發(fā)酵時(shí)間0～7d、糖濃度0～12.5g/100mL和固液比5g/100mL～30g/100mL條件下，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)、葡萄糖濃度越高、固液比越小脫鈣效果越好。綜合考慮葡萄糖濃度與固液比兩個(gè)因素，葡萄糖質(zhì)量與蟹殼質(zhì)量比在2∶1時(shí)效果最好，脫鈣率為95.5%；其比值為1∶1時(shí)脫鈣率約為90%。理想條件下乳酸菌利用1mol葡萄糖產(chǎn)生2mol乳酸，而2mol的乳酸剛好與1mol碳酸鈣反應(yīng)生成1mol乳酸鈣。在此理想條件下假設(shè)蟹殼中碳酸鈣含量為50%，計(jì)算得乳酸與碳酸鈣摩爾比為2.2∶1，與實(shí)際反應(yīng)過(guò)程中二者的比例相近。因此利用乳酸菌發(fā)酵蟹殼脫鈣，需要選擇利用葡萄糖產(chǎn)乳酸效率高的菌株。

[1]JUNG W J,JO G H,KUK J H,et al.Demineralization of crab shells by chemical and biological treatments[J].Biotechnol Bioproc Eng,2005,10(1):67-72.

[2]ROBINSON-LORA MA,BRENNAN RA.The use of crab-shell chitin for biological denitrification:batch and column tests[J].Bioresource Technol,2009,100:534-541.

[3]陳 亞.提取甲殼素的乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（20）：4607-4609．

[4]OH KT,KIM YJ,NGUYEN VN,et al.Demineralization of crab shell waste byPseudomonas aeruginosaF722[J].Process Biochem,2007,42(7):1069-1074.

[5]岳 敏，曹海龍，李曙光，等.誘變選育以菊芋為原料高產(chǎn)甘露醇的乳酸菌[J].中國(guó)釀造，2012，31（9）：53-56．

[6]黃 璠，張為巍，周銘鋒，等.鼠李糖乳桿菌CLRI發(fā)酵蝦殼脫鈣的條件及培養(yǎng)基優(yōu)化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：190-193.

[7]JUNG WJ,KUK JH,KIM KY,et al.Demineralization of crab shell waste by lactic acid fermentation[J].Appl Microbiol Biot,2005,67:851-854.

[8]SHIRAI K,GUERRERO I,HUERTA S,et al.Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation[J].Enzyme Microb Tech,2001,28:446-452.

[9]AYTEKIN O,ELIBOL M.Cocultivation ofLactococcus lactisand Teredinobacter turnirae for biological chitin extraction from prawn waste[J].Bioprocess Biosyst Eng,2010,33:393-399.