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    順鉑誘導宮頸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究*

    2013-09-21 07:22:08丁莉利王明華
    重慶醫(yī)學 2013年15期
    關鍵詞:細胞株緩沖液宮頸癌

    楊 丞,饒 翔,丁莉利,王明華

    (1.海南醫(yī)學院病理教研室,海南海口571101;2海南省海口市人民醫(yī)院病理科,海南???70208)

    上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞的過程。近年有學者通過比較多種耐藥細胞系和其親本細胞系的形態(tài)和檢測EMT標記性蛋白的表達,證實耐藥細胞株發(fā)生EMT改變,并使細胞侵襲力增強[1]。但在化療藥物干預早期,EMT能否發(fā)生、發(fā)生的時間點及其與腫瘤細胞侵襲能力和耐藥性之間的關系等問題,目前尚不清楚。本文通過體外細胞學實驗研究,以低劑量短時間給藥處理,詳細觀察順鉑誘導低分化宮頸癌HCE1細胞株EMT的時間點及其與腫瘤細胞侵襲能力和耐藥性之間的關系,并明確Twist1是否為調(diào)控順鉑誘導宮頸癌細胞EMT的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。

    1 材料與方法

    1.1 材料 實驗細胞:人低分化宮頸癌HCE1細胞株購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。主要試劑:高糖亞甲基雙丙烯酰胺(dulbecco′s modified eagle′s medium,DMEM)培養(yǎng)基購自Gibco公司,新生牛血清購自杭州四季青公司,胰蛋白酶和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Amersco公司,四甲基偶 氮 唑 鹽 (3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)試劑購自Sigma公司,Transwell小室購自Corning Coster公司,基底膜Matrigel購自BD Biosciences公司,順鉑(批號:H37021358)購自山東齊魯制藥廠,相對分子質(zhì)量300.3Da。一抗抗體Vimentin、E-Cadherin、PGlycoprotein購自ProMab公司。二抗羊抗鼠/兔抗體免疫組織化學試劑盒購自邁新公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司,cDNA Synthesis Kit購自TOYOBO公司,PCR Master Mix(0.05units/uL Taq DNA Polymerase in reaction buffer,4 mmol MgCl2,0.4mmol dNTP)購自 Fermentas公司,DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司,AGAROSE購自AMRESCO公司,10×DNA上樣緩沖液購自ProMab公司。PCR引物用Primer premier 5.0軟件設計,由Invitrogen公司合成。引物序列及產(chǎn)物長度如下:Twist上游引物:5′-GAG TCC GCA GTC TTA CGA G-3′,下 游 引 物:5′-ATC CTC CAG ACC GAG AAG-3′,長度282bp;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上 游 引 物:5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC -3′,下 游 引 物:5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′,長度450bp。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)并形態(tài)觀察 以HCE1細胞株為對照組,加順鉑組(終濃度0.1mg/L)為實驗組,分別以相同的細胞量接種到培養(yǎng)瓶,加入10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)基置37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育,分別于24、48、72、96h等以倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照,比較細胞形態(tài)差異,尋找順鉑誘導細胞EMT的時間點。

    1.2.2 細胞生長曲線測定方法 待以上細胞長至對數(shù)生長期,用胰酶消化后重懸并進行細胞計數(shù),在96孔板每孔加入100μL(104/mL)細胞,各設3個平行孔,置37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),待24h后吸取實驗組培養(yǎng)液加入100μL含順鉑的培養(yǎng)液(終濃度0.1mg/L)。再過24h每孔加10μL MTT(5g/L),37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后棄上清液,每孔再加200μL DMSO,出現(xiàn)藍紫色顆粒結(jié)晶并充分溶解后于570nm處測光密度(OD)值,連續(xù)6d。然后以OD值為縱軸,時間為橫軸繪制細胞生長曲線,比較生長趨勢差異。

    1.2.3 細胞免疫組織化學檢測方法 以HCE1細胞株為對照組,在EMT時間點的細胞為EMT組,取生長狀態(tài)良好的細胞玻片,D-Hank′s緩沖液清洗2次,于固定液固定10min,1×PBS緩沖液(0.01mol/L,pH 7.2)洗滌細胞片5min×3次,3%H2O2室溫孵育10min,再用1×PBS緩沖液洗滌5min×3次;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min,甩去多余液體,滴加一抗50μL,4℃過夜;1×PBS緩沖液洗滌5min×3次,滴加復合二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG),室溫靜置20 min,1×PBS洗滌5min×3次;二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色約4min,浸入自來水終止顯色,蘇木精復染,乙醇分化1s,自來水沖洗15min,入乙醇脫水二甲苯透明;中性樹膠封片,鏡檢。比較兩組細胞陽性染色差異。

    1.2.4 腫瘤細胞侵襲實驗方法 用50mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃風干;消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌2遍,用含牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至5×104/mL;Transwell小室6孔板下室加入1mL含胎牛血清(Fetal calf serum,F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基,上室加入細胞懸液,每組設3個平行孔,培養(yǎng)細胞24h。用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞,用95%乙醇固定15min,蘇木素染色10min,200倍光鏡視野下計數(shù)5個視野,計算平均細胞穿孔數(shù)。

    1.2.5 半定量RT-PCR檢測Twist1表達方法 每組取107個細胞加入1mL Trizol試劑消化,室溫靜置5min后加入0.2 mL氯仿,震蕩15s后在4℃下12 000r/min離心15min,將水樣層轉(zhuǎn)移至干凈的試管,加入0.5mL異丙醇,混勻后-20℃下靜置15min,在4℃下12 000r/min離心10min,移去上層懸液,將RNA沉淀用1mL 75%乙醇洗滌,在振蕩器上混勻后4℃下7 500r/min離心5min,棄去上清液。適度干燥RNA沉淀后,加入適量0.1%焦磷酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水,使RNA完全溶解。2 000r/min離心20s。紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,評估RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄體系如下:總RNA 1μL,Oligo(dT)20(0.01mol/L)1μL,無 RNase水10μL,5×RT Buffer 4μL,dNTP混合物(0.01mol/L)2μL,RNase抑制劑(10u/μL)1μL,逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,在42℃反應20min,99℃反應5min,4℃反應5min,即完成cDNA第一鏈合成。PCR反應體系如下:cDNA模板1μL,引物(10μmol/L)1μL,PCR Master混合液(成分見材料)12.5μL,PCR緩沖液10.5μL,在95℃預變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40個循環(huán);72℃延伸5min。取8μL PCR產(chǎn)物加入2μL上樣緩沖液中于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳(90v30min),用VDS凝膠成像儀攝影后進行灰度掃描,計算各擴增產(chǎn)物與GADPH的比值。重復3次。

    1.3 統(tǒng)計學處理 利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 細胞形態(tài) 分別于24、48、72、96h在顯微鏡下比較兩組細胞的形態(tài),發(fā)現(xiàn)實驗組細胞在72h發(fā)生EMT的形態(tài)改變:連接緊密的細胞變得扁平,更趨于梭形,且失去了大部分細胞連接(圖1)。72h即為HCE1發(fā)生EMT的時間點。

    圖1 兩組72hHCE1細胞形態(tài)(倒置顯微鏡×100)

    2.2 細胞生長曲線 實驗組細胞生長趨勢于72h前稍慢于對照組,72h后生長趨勢逐漸與對照組接近,96h后兩組細胞均進入平臺期,生長趨勢基本重合,見圖2。

    2.3 細胞免疫組織化學檢測結(jié)果 細胞黏附分子(E-cadharin)定位于細胞膜和細胞間橋處,對照組高表達,EMT組表達減少;vimentin定位于細胞膜及細胞質(zhì)處,對照組有表達,EMT組表達增加;P糖蛋白(P-gp)定位于細胞膜及細胞質(zhì)處,對照組有表達,EMT組表達增加,見圖3。

    2.4 腫瘤細胞侵襲結(jié)果 對照組HCE1細胞的平均穿膜細胞數(shù)為(39.000 0±2.828 4)個,EMT組HCE1的平均穿膜細胞數(shù)為(100.166 7±3.868 7)個,EMT組較對照組細胞多,侵襲能力EMT組強于對照組,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

    圖2 宮頸癌細胞株HCE1MTT生長曲線

    圖3 兩組HCE1細胞標志蛋白的免疫組織化學檢測(SP法×200)

    圖4 兩組HCE1細胞侵襲能力檢測(倒置顯微鏡×200)

    圖5 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

    2.5 半定量RT-PCR檢測Twist1表達 對照組HCE1總RNA A260/A280為1.873 0,EMT組為1.904 0。對照組各條帶OD值與內(nèi)參OD比值為0.200 2±0.000 9,EMT組為0.615 6±0.005 1,EMT組Twist1表達比對照組增強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5。

    3 討 論

    EMT是胚胎發(fā)育中形態(tài)生發(fā)的一個關鍵過程,以上皮細胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征,具體包括:細胞黏附分子(E-cadherin)表達減少;角蛋白為主的細胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募毎羌?,從而引起細胞形態(tài)的改變[2]。

    本實驗研究顯示,宮頸癌HCE1細胞經(jīng)過低劑量順鉑處理72h可發(fā)生EMT的形態(tài)變化,上皮細胞標志性蛋白E-cadherin表達減少、間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin表達增強進一步證明EMT的發(fā)生。從生長曲線來看,生長曲線趨勢72h前實驗組慢于對照組,提示順鉑對腫瘤細胞有一定的殺傷作用,引起細胞的凋亡,72h后生長趨勢逐漸接近并與對照組重合,說明順鉑誘導宮頸癌細胞發(fā)生EMT后,細胞生長速度會增快,因此,低劑量順鉑誘導宮頸癌細胞發(fā)生EMT是一個早期事件。

    順鉑是宮頸癌化療的一線藥物,但宮頸癌細胞對化療藥物獲得性耐藥是化療失敗的主要原因,尤其用小劑量化療藥物誘導宮頸癌細胞,更易導致耐藥的產(chǎn)生[3]。近年研究表明,多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1,MDR-1)編碼的 P-gp的過表達與多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)發(fā)生有關[4],而P-gp蛋白表達升高的腫瘤細胞具有增強的侵襲轉(zhuǎn)移能力,提示化療藥物誘導腫瘤細胞耐藥性和侵襲性增強之間存在內(nèi)在聯(lián)系[5-6]。最近的研究證實腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥還與EMT相關[7-8]。本實驗顯示EMT組HCE1細胞體外侵襲能力增強,P-gp蛋白表達增強,也從細胞生物學特性上證實低劑量順鉑誘導宮頸癌細胞HCE1發(fā)生了EMT。從上可知化療藥物在治療早期誘導EMT是使宮頸癌化療失敗的關鍵性原因。因此,早期阻止EMT的發(fā)生,對防止形成耐藥性、降低轉(zhuǎn)移的風險有重要意義。

    本實驗中順鉑誘導宮頸癌細胞HCE1發(fā)生EMT后,Twist1表達明顯高于EMT前,可以證實Twist1與宮頸癌細胞EMT的發(fā)生密切相關,是調(diào)節(jié)順鉑誘導HCE1發(fā)生EMT的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。而堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的轉(zhuǎn)錄因子Twist,已 被 證 實 在 胃 癌[9-10]、乳 腺 癌[11-12]、前 列 腺 癌[13]、肝癌[14]這些實體腫瘤存在過表達,Twist表達的升高還與腫瘤的分期、預后有關[15]。本研究結(jié)果提示,針對Twist的基因抑制在宮頸癌化療中可望產(chǎn)生協(xié)同作用,為提高臨床腫瘤化療效果提供一種新思路。

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