三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖及其PI3K－Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

朱 峰，張 艷，何 巖，張會(huì)清，張英杰

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南新鄉(xiāng)453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453001）

腎癌是腫瘤始發(fā)于泌尿小管上皮，逐漸進(jìn)入腎盂、腎盞，甚至輸尿管，且主要以血尿、腰痛和腹部腫塊等“腎癌三聯(lián)征”為主要臨床特征的一類疾病。腎癌約是成人最常見的腎臟腫瘤。男女比例約為2∶1，可見于各個(gè)年齡段，高發(fā)年齡50～70歲。三氧化二砷可傷害神經(jīng)系統(tǒng)、影響毛細(xì)血管通透性，對(duì)皮膚和黏膜有刺激作用，被認(rèn)為是最古老的毒物之一。然而該化合物的藥用價(jià)值最開始被張亭棟揭示出后，科研人員才開始關(guān)注它。如今三氧化二砷已經(jīng)被制成水劑，通過(guò)靜脈注射給急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，總緩解率達(dá)到90%。且大量研究證實(shí)，三氧化二砷可抑制肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、宮頸癌Hela和人口腔鱗狀癌細(xì)胞的增殖，對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤可能有一定抑制作用［1－4］。為了探討三氧化二砷是否在腎癌中發(fā)揮抗癌的效果，本研究選擇了人腎癌細(xì)胞786－O作為研究模型，從細(xì)胞水平初步探討三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響，并深入研究其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786－O從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買，目錄號(hào)TCHu186。將購(gòu)買的細(xì)胞接種于RPMI－1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清和50μg／mL青鏈霉素），5%CO2，培養(yǎng)箱濕度為90%，37℃培養(yǎng)3d。每培養(yǎng)3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和設(shè)計(jì) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別接種于96孔板中，并在5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)96孔底部的60%面積貼滿細(xì)胞后，吸去培養(yǎng)基并更換新的RPMI－1640培養(yǎng)基。5%CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。最后將90孔細(xì)胞分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組45個(gè)孔。加入藥物（0.5μM 或1.0μM三氧化二砷）和生理鹽水之后分別于0、12、24h取出15個(gè)孔細(xì)胞，使用BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每孔細(xì)胞DNA合成量，使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)磷酸肌醇3激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）相對(duì)mRNA表達(dá)量，使用免疫印跡法（western blot）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 BrdU摻入實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［5］介紹的方法，在收集待測(cè)孔細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)前4h時(shí)向每個(gè)孔中加入一定量BrdU母液至BrdU終濃度為100mM，5%CO237℃培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫，1 700r／min離心5min，去上清液，加入10mL 70%EtOH重懸。用洗滌緩沖液（PBS＋0.5%IFS）洗滌。離心去上清液，以0.5mL 2M HCl＋0.5%IFS，室溫孵育20min。加入1mL洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞。離心去上清液，以0.1M的四硼酸鈉（Na2B4O7）重懸細(xì)胞，室溫孵育2min。用1mL洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2次。用50μL洗滌緩沖液重懸細(xì)胞，加入anti－BrdU抗體，4℃孵育20min。加入1.5mL洗滌緩沖液洗1次。用50μL洗滌緩沖液重懸細(xì)胞，加入用于FITC結(jié)合Fc段的抗體，4℃孵育20 min。加入1.5mL洗滌緩沖液洗滌1次。在450nm的波長(zhǎng)處讀取吸光值，用于定量每個(gè)孔內(nèi)DNA合成量。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR） 取出不同時(shí)間（0、12、24h）對(duì)照組和觀察組3個(gè)孔的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗脫，1 700r／min離心5min，去上清液，收集細(xì)胞。使用TRIzol Reagent試劑盒抽提細(xì)胞的總mRNA，并用DEPC水定量至5μg／μL。使用PrimeScript One Step RT－PCR Kit將總mRNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA，并定量。特異性引物為GAPDH－F：5′－TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC－3′；GAPDH－R：5′－GCT CCT GGA AGA TGG TGA TGG－3′；PI3K－F：5′－TTT CTC ATG GCT GTC CTT CAG－3′，PI3K－R：5′－CAG GAG AAT CTA ACG GAT GC－3′；Akt－F：5′－CAT CAC ATC TGG TTT CCT TGG－3′，Akt－R：5′－AAC TGG AAA TGT AAT TTT GGG－3′，均為上海生工產(chǎn)品。以GAPDH為內(nèi)參，使用SYBR Green RT－PCR試劑盒和使用伯樂(lè)的IQ5PCR系統(tǒng)擴(kuò)增cDNA中的組織因子基因片段和GAPDH基因片段，反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃變性5min，94℃變性30s，57℃退火1min，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。計(jì)算每個(gè)樣品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法計(jì)算每個(gè)樣品中TF的mRNA轉(zhuǎn)錄倍數(shù)［6］。

1.5 1.5 免疫印跡 取出不同時(shí)間（0、12h和24h）對(duì)照組和觀察組3個(gè)孔的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗脫，400×g或1 700r／min離心5min，去上清液，用緩沖溶液［50mmol／L Tris－HCl，pH 7.4，150mmol／L NaCl，1%Nonidet P－40，0.5%去氧膽酸，0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS），5mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA），2mmol／L苯甲基磺酰氟（PMSF），20g／mL抑肽酶，20g／mL亮抑肽酶，10g／mL胃蛋白酶抑制劑 A，150 mmol／L苯甲脒］重懸細(xì)胞至5×1010個(gè)。抑肽酶破碎后12 000r／min離心20min后取上清液進(jìn)行電泳。使用5%濃縮膠和15%分離膠進(jìn)行電泳分離，并使用電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%牛奶封閉PVDF膜1h，37℃孵育一抗1h，然后PBST清洗3次，每次5min，然后用37°孵育二抗稀釋液，并用PBST清洗3次，每次5min。最后用ECL＋plusTM免疫印跡系統(tǒng)試劑盒（Amersham，USA）配置顯光液，然后使用3490 Photo凝膠成像系統(tǒng)（Epson，Japan）拍照并記錄，并用Image Pro PLUS軟件分析每個(gè)蛋白與GAPDH的相對(duì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有連續(xù)資料均采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。所有離散資料均采用卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以χ2表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響 使用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)786－O在三氧化二砷（觀察組）和PBS（對(duì)照組）刺激下DNA合成量，用以評(píng)價(jià)三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響。從表1和圖1可知，0.5μM和1μM三氧化二砷刺激24h后，觀察組DNA合成量顯著低于0h時(shí)的DNA合成量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從表2和圖2可知，0.5μM三氧化二砷刺激24h后且均顯著低于0h和12h的對(duì)照組DNA合成量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明0.5μM三氧化二砷刺激24h有效地抑制人腎癌細(xì)胞786－O增殖。

表1 不同濃度As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響（±s）

表1 不同濃度As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響（±s）

組別 0μM 0.5μM 1μM 1.615±0.275 2.713±0.314 3.014±0.252觀察組對(duì)照組1.543±0.243 0.824±0.273 0.513±0.214

表2 不同時(shí)間As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響（±s）

表2 不同時(shí)間As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響（±s）

組別0h 12h 24h對(duì)照組1.235±0.125 2.463±0.214 3.952±0.418觀察組1.275±0.243 0.946±0.153 0.642±0.114

圖1 不同濃度As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響

2.2 三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖中PI3K和Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 使用RT－PCR來(lái)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（0、12和24h）觀察組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt mRNA相對(duì)的表達(dá)量（表3、表4和圖3）。結(jié)果顯示，在0、12和24h時(shí)觀察組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt mRNA相對(duì)的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt mRNA相對(duì)的表達(dá)量隨著細(xì)胞增殖加快逐漸升高。說(shuō)明0.5μM三氧化二砷有效地抑制人腎癌細(xì)胞786－O增殖內(nèi)PI3K和Akt的轉(zhuǎn)錄水平。

圖2 不同時(shí)間As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖的影響

表3 PI3KmRNA的相對(duì)GAPDH mRNA的輝度結(jié)果

表4 Akt mRNA的相對(duì)GAPDH mRNA的輝度結(jié)果

圖3 As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖中PI3K和Akt表達(dá)的影響

圖4 As2O3對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖中PI3K和Akt蛋白表達(dá)的影響

2.3 三氧化二砷對(duì)人腎癌細(xì)胞786－O增殖中PI3K和Akt蛋白表達(dá)的影響 使用免疫印跡法來(lái)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（0、12和24h）觀察組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt蛋白的表達(dá)量（表5，表6和圖4）。在0、12和24h時(shí)觀察組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)PI3K和Akt mRNA相對(duì)的表達(dá)量隨著細(xì)胞增殖加快逐漸升高。說(shuō)明1μM三氧化二砷有效地抑制人腎癌細(xì)胞786－O增殖內(nèi)PI3K和Akt的轉(zhuǎn)錄水平。說(shuō)明0.5μM三氧化二砷有效地抑制人腎癌細(xì)胞786－O增殖內(nèi)PI3K和Akt的蛋白的表達(dá)量。

表5 PI3K蛋白表達(dá)的輝度結(jié)果

表6 Akt蛋白表達(dá)的輝度結(jié)果

3 討 論

大量研究均表明了三氧化二砷抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及具有顯著臨床療效。研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可以抑制誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡、并通過(guò)與cytokeratin 18結(jié)合以及下調(diào)hTERT mRNA的表達(dá)而發(fā)揮其作用［7－8］。同樣，三氧化二砷可抑制人淋巴細(xì)胞系T2的增殖，研究發(fā)現(xiàn)它可能通過(guò)調(diào)控SHP－1啟動(dòng)子以及CpG島的功能，來(lái)干擾正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的增殖［9］。另外三氧化二砷還可抑制肝癌細(xì)胞以及早幼粒白血病細(xì)胞的增殖，其中，研究最深入的是其在抑制早幼粒白血病細(xì)胞增殖、凋亡和死亡的研究［10－11］。而且有很多報(bào)道發(fā)現(xiàn)了該分子在治療白血病的臨床療效，例如張德芳等［12］采用全反式視黃酸（ATRA）與三氧化二砷和化療藥物聯(lián)合方案治療初診急性早幼粒細(xì)胞白血病，總有效率達(dá)到96.9%，且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。另外，根據(jù)哈爾濱醫(yī)學(xué)院的臨床實(shí)踐，瑞金醫(yī)院血液科針對(duì)早幼粒白血病采用三氧化二砷治療，并進(jìn)行了一系列的研究，在國(guó)際上首先證實(shí)了三氧化二砷的應(yīng)用可以特異誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡。使得復(fù)發(fā)難治白血病得了突破，CR率可達(dá)到80%～90%，部分患者得以長(zhǎng)期生存。從而開啟了三氧化二砷用于白血病以及其他腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

雖然如此，但三氧化二砷作為一種劇毒分子，對(duì)泌尿系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒性作用，因此，有關(guān)三氧化二砷與腎癌的相關(guān)研究較少［13］。目前已經(jīng)清楚的是，0.5～2μM的三氧化二砷可用于治療早幼粒細(xì)胞白血病，且通過(guò)靜脈注射注入人體后對(duì)機(jī)體其他器官和系統(tǒng)的損傷較小。因此，本研究選擇研究不同劑量三氧化二砷作用不同時(shí)間對(duì)腎癌細(xì)胞的影響，以探討在最低有效濃度下三氧化二砷治療腎癌的潛在臨床價(jià)值。結(jié)果表明0.5μM三氧化二砷刺激24h可顯著抑制了人腎癌細(xì)胞786－O增殖。為了進(jìn)一步探討0.5μM三氧化二砷抑制人腎癌細(xì)胞786－O增殖的作用機(jī)制，本研究選擇研究該藥物對(duì)PI3K－Akt細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。PI3K－Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的主要信號(hào)途徑，由于抑制基因PTEN的低表達(dá)從而誘導(dǎo)了PI3K的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了Akt分子的表達(dá)和磷酸化，從而開啟了細(xì)胞內(nèi)蛋白合成和DNA合成途徑，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量增殖。同樣人腎癌細(xì)胞786－O的增殖同樣受PI3K－Akt信號(hào)途徑調(diào)控。本課題組研究發(fā)現(xiàn)0.5μM三氧化二砷在抑制人腎癌細(xì)胞786－O細(xì)胞增殖的同時(shí)，也抑制PI3K的mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而阻礙了Akt的表達(dá)。因此，可以得出，PI3K－Akt信號(hào)途徑參與了三氧化二砷抑制人腎癌細(xì)胞增殖的過(guò)程，且更明確表明了三氧化二砷在治療腎癌中的潛在臨床價(jià)值。

另外，三氧化二砷雖然可通過(guò)抑制PI3K－Akt信號(hào)途徑來(lái)發(fā)揮抑制人腎癌細(xì)胞增殖，但本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行了研究。有關(guān)三氧化二砷對(duì)腎癌的臨床療效，還需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)，并要比較不同濃度下三氧化二砷的效果以及對(duì)動(dòng)物泌尿系統(tǒng)的毒性作用。

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