ERCC1與RRM1在胰腺癌組織中的表達及臨床意義

柴文剛 王廣義 謝淑麗 王 蒙 (吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

胰腺癌半數以上位于胰頭，約90%是起源于腺管上皮的管腺癌(PDA)。核酸剪切修復偶聯因子1(ERCC1)定位于19q 13.2，是核苷酸外切修復酶家族中的重要成員之一，是細胞存活必需的DNA修復基因，具有損傷的識別和切除功能，其表達的高低能反映整個DNA切除修復(NER，核酸切除修復)活性的水平〔1〕。RRM1基因主要定位在人類染色體的11q15.5區(qū)域。這恰好也是一個多種惡性腫瘤疾病可能出現雜合子丟失現象的區(qū)域，其作用主要是為DNA修復提供原料〔2〕。研究顯示ERCC1與RRM1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐受有關〔3〕。目前對兩種基因的研究主要集中在非小細胞肺癌中，胰腺研究罕有報道。本實驗通過免疫組化方法檢測ERCC1及RRM1在PDA中的表達，明確其在PDA中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例收集及分組 收集吉林大學第一醫(yī)院2009年1月至2012年6月胰腺癌手術切除標本34例，男性24例(70.6%)，女性10例(29.4%)，年齡22～72歲，平均(55.2±12.8)歲。病理類型均為PDA，其中高分化(中高、高分化)12例(35.3%)，低分化(中、中低、低分化)22例(64.7%);腫瘤直徑＜3 cm 18例(52.9%)，≥3 cm 16例(47.1%);發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移18例(52.9%)。選取34例患者的癌旁組織(距癌組織≥3 cm)，另收集正常胰腺組織20例。以上標本均經4%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2 主要試劑 一抗為兔抗人ERCC1、RRM1多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司。稀釋液以0.01 mol/L PBS與10 mg/ml BSA與0.1%疊氮Na組成，稀釋1∶400。免疫組化染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。試劑盒組成:A液，內源性過氧化物酶阻斷劑;B液，動物非免疫血清(羊);C液，生物素標記的羊抗鼠/兔IgG;D液，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶。DAB工作液配制:A、B、C液各50 μl按順序加入到0.85 ml的蒸餾水中，混勻后備用。

1.3 方法 ERCC1和RRM1染色方法均為SABC免疫組化法。細胞質和(或)細胞核內含棕黃色顆粒者為陽性細胞。根據切片中陽性細胞著色程度評分(無著色0分，弱著色1分，中度著色2分，強度著色3分)。ERCC1陽性細胞率評分(＜1%，0分;1% ～9%，1分;10% ～24%，2分;25% ～50%，3分;＞50%，4分)，兩評分之積為該病理切片評分值，且將評分值＜3分定為低表達病例，≥3分定為高表達病例。RRM1陽性細胞率評分(＜1%，0分;1% ～9%，1分;10% ～50%，2分;≥50%，3分)，同樣以兩評分之積為樣本評分，≥6分為高表達，＜6分為低表達。陰性對照以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作為陰性對照。免疫組化染色結果經兩位有經驗的病理醫(yī)生進行雙盲觀察計數，根據以上評分標準統計最終樣本得分。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行χ2檢驗及Fisher精確概率法檢驗。

2 結果

ERCC1在腫瘤組34例中高表達者14例(41.2%)，其中高分化組高表達6例(50.0%)低分化組高表達83例(36.4%);發(fā)生淋巴結轉移組高表達6例(33.3%)，無淋巴結轉移組高表達8例(50.0%);腫瘤直徑≥3 cm組高表達者6例(37.5%)，腫瘤＜30 m組高表達8例(44.4%);癌旁組(n=34)23例(67.6%)高表達;正常胰腺組(n=20)高表達者 14例(70.0%)。RRM1在腫瘤組34例中高表達者10例(29.4%)，其中高分化組高表達4例(33.3%)，低分化組高表達6例(27.3%);發(fā)生淋巴結轉移組高表達6例(33.3%)，無淋巴結轉移組高表達4例(25.0%);腫瘤直徑≥3 cm組高表達者4例(25.0%)，腫瘤直徑＜3 cm組高表達6例(33.3%)。癌旁組(n=34)18例(52.9%)高表達;正常胰腺組(n=20)高表達者16例(80.0%)，腫瘤組與癌旁組及正常胰腺組比較ERCC1、RRML陽性率有顯著性差異(P＜0.05)。腫瘤組腫瘤大小、有無淋巴結轉移、高、低分化與ERCC1、RRML陽性率無關(均P＞0.05)。見圖1，圖2。

圖1 免疫組化染色檢測ERCC1表達(×200)

圖2 免疫組化染色檢測RRM1表達(×200)

3 討論

ERCC1在人類DNA損傷修復中扮演著重要角色，尤其是修復紫外線所致的嘧啶二聚體與鉑-DNA加合物中。ERCC1缺乏的細胞會產生修復缺陷。到目前為止，ERCC1與腫瘤的研究發(fā)現，在人群中ERCC1低表達者患腫瘤的風險高，如肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等〔4，5〕，但在胰腺中的作用尚未闡明。國內研究顯示，在誘導產生胰腺癌的SD大鼠中，胰腺癌組織的ERCC1表達率顯著低于非癌胰腺組織〔6〕。國外眾多研究結果不一，有人認為ERCC1的高表達是臨床預后不良的獨立危險因素〔7〕。ERCC1的低表達可能促使該人群易暴露于致癌物質中，導致胰腺癌的發(fā)生。當ERCC1與XPD、XPG、XPA等修復基因將DNA鏈中受損的部分切除后，DNA鏈上留下的空缺就由RRM1提供的核苷酸來填補。它是RNA合成的前體，參與核糖核苷酸還原成脫氧核糖核酸的過程，為DNA修復的限速酶。RRM1的研究主要集中于非小細胞肺癌中〔5〕，與之相反，在胰腺癌中RRM1的表達低于癌旁組織及正常胰腺組織，進一步證明，胰腺癌的發(fā)生可能與自身DNA損傷修復受到抑制或表達缺失有關。

ERCC1與RRM1是化療藥物鉑類與吉西他濱耐藥的關鍵基因〔8，9〕。而目前用于臨床的一線化療方案正是基于吉西他濱，如何減少化療耐受、延長患者的生存時間及復發(fā)時間成為目前胰腺癌治療的熱點。根據基因表達的高低，化療方案個體化，避免耐受藥物的使用，可提高敏感性，降低毒副作用。

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2 陳 芹，周彩存，張 頡.ERCC1、RRM1和BRCA1在非小細胞肺癌中的表達及預后意義〔J〕.腫瘤，2007;27(9):719-22.

3 Valsecchi ME，Holdbrook T，Leiby BE，et al.Is there a role for the quantification of RRM1 and ERCC1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕?BMC Cancer，2012;12(3):104.

4 劉美榮，王濰博.胃癌組織與癌旁組織中ERCC1 AKT1的表達及臨床意義〔J〕.山東大學學報 (醫(yī)學版)，2010;48(3):86-101.

5 傅建民，周 頡，謝建生，等.乳腺癌新輔助化療對ERCC1基因表達的影響〔J〕.南方醫(yī)科大學學報，2008;28(4):603-5.

6 楊竹林，李清龍，鄧星輝，等.大鼠胰腺癌和非癌胰腺組織DNA損傷修復蛋白表達及意義〔J〕.醫(yī)學研究雜志，2009;38(2):60-4.

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8 Jae Jin Lee，Chi Hoon Maeng，Seon Kyung Baekb，et al.The immunohistochemical overexpression of ribonucleotide reductase regulatory subunit M1(RRM1)protein is a predictor of shorter survival to gemcitabinebased chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)〔J〕.Lung Cancer，2010;70(2):205-10.

9 Lee S，Park YH，Kim KH，et al.Thymidine synthase，thymidine phosphorylase，and excision repair cross-complementation group 1 expression as predictive markers of capecitabine plus cisplatin chemotherapy as firstline treatment for patients with advanced oesophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2010;103:845-51.