褪黑素對阿爾茨海默病樣細胞總tau蛋白表達的影響

吳敏霞 謝捷明 周琳瑛 (福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系電鏡室，福建 福州 350004)

正常生理條件下，大腦中tau蛋白存在于神經(jīng)元的軸突中，可促進微管蛋白聚集成微管并增強其穩(wěn)定性、維持細胞的生長發(fā)育，且在神經(jīng)系統(tǒng)的形成和軸突的通訊傳導中起著至關(guān)重要的作用〔1〕。褪黑素(MLT)為體內(nèi)松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學結(jié)構(gòu)為 N-乙酰-5-甲氧基色胺，現(xiàn)可人工合成。MLT具有某些重要的神經(jīng)精神作用，如抗衰老、催眠、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、腦細胞損傷保護等作用。在AD患者，tau蛋白被異常過度磷酸化。課題組前期的研究也證明OA作用于NG108-15細胞導致細胞Ser-396位點磷酸化tau蛋白表達增高，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細胞模型〔2〕。在此基礎(chǔ)上，本實驗用細胞免疫化學及細胞免疫印跡技術(shù)觀察MLT對此AD樣細胞總tau蛋白水平的影響，進而明確褪黑素對AD樣細胞的拮抗作用，對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 岡田酸(OA)為Sigma公司產(chǎn)品，用DMSO配成20 μmol/L的母液，分裝備用。鼠抗tau蛋白單克隆抗體(Tau-5)，Neomarkers公司產(chǎn)品。Marker，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品。大鼠神經(jīng)母細胞和小鼠膠質(zhì)細胞瘤細胞的雜交細胞系NG108-15細胞。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NG108-15細胞用含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，待細胞間隙變得較明顯，細胞突起有所回收時終止消化，1640培養(yǎng)液吹打成單個細胞懸液，3～4 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫細胞化學染色 利用總tau蛋白的抗體(Tau-5)，采用免疫細胞化學技術(shù)(ABC方法)顯示總tau蛋白在細胞內(nèi)的表達。

1.2.3 Western印跡法 細胞勻漿制備:將種在6孔板上的細胞，每孔加入細胞裂解液60 μl，裂解20 min，用自制的刮匙刮下，于4℃，離心10 min，吸取上清蛋白，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

1.2.4 蛋白條帶密度分析法 采用ImageMaster?VDS凝膠成像及分析系統(tǒng)，于可見光下采集膜上的蛋白條帶圖像，通過與標準條帶密度相比較，計算各條帶密度相對值。

2 結(jié)果

2.1 免疫細胞化學染色法 見圖1，OA 10 nmol/L作用于NG108-15細胞6 h，加入MLT預(yù)處理，MLT濃度為100 μmol/L，提前1 h作用。實驗結(jié)果表明MLT處理組較模型組細胞總tau蛋白表達增高，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞漿和軸突的染色與對照組相比明顯變濃，提示MLT可增高AD樣細胞總tau蛋白水平。

圖1 MLT對NG108-15擬AD樣細胞總tau蛋白表達的影響(DAB，×400)

圖2 MLT對NG108-15擬AD樣細胞總tau蛋白表達的影響

2.2 細胞免疫印跡 圖2實驗結(jié)果顯示MLT各處理組細胞總tau蛋白表達增強，提示MLT可明顯提高細胞總tau蛋白的表達。與模型組比較，低劑量MLT處理組細胞tau蛋白總水平表達明顯增加。結(jié)合條帶密度分析法，模型組、低劑量MLT處理組、高劑量MLT處理組各條帶密度值分別為0.012±0.008，0.085±0.013(P＜0.01)，0.074±0.008(P＜0.01)，低劑量與高劑量MLT處理組差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

AD病是由多種因素引起的一種病理過程，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)是其典型的組織病理學改變。NFT由成對螺旋絲(PHF)組成，PHF的主要是由異常磷酸化tau蛋白的微管結(jié)合區(qū)的自我結(jié)合所導致的。

AD腦內(nèi)的神經(jīng)元的蛋白激酶系統(tǒng)和磷酸酯酶系統(tǒng)之間的失衡被認為是tau蛋白過度磷酸化的原因。OA是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。NG108-15細胞系，它是小鼠成神經(jīng)細胞瘤和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的融合雜種系，朱粹青等〔3〕用OA誘導 NG108-15細胞，發(fā)現(xiàn)NG108-15細胞發(fā)生了tau蛋白的過度磷酸化。課題組前期的研究也證明OA作用于NG108-15細胞導致細胞ser-396位點tau蛋白過度磷酸化，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細胞模型〔2〕。

細胞內(nèi)總tau蛋白包括磷酸化tau蛋白和非磷酸化tau蛋白，本實驗研究結(jié)果顯示，MLT使模型組細胞總tau蛋白水平明顯提高，前期研究顯示 MLT使其磷酸化tau蛋白水平降低〔2〕，推論出MLT能增高AD樣細胞非磷酸化tau蛋白水平，表明MLT能通過提高非過度磷酸化tau蛋白的表達來維持tau蛋白的正常功能，促進微管組裝與維持正常軸漿流，保證神經(jīng)元功能的正常運行;本文結(jié)果說明MLT對總tau蛋白的作用與劑量不成比例。

在AD細胞模型中，用MTL進行預(yù)處理，研究總tau蛋白和磷酸化tau蛋白表達的變化，可以推斷出非磷酸化tau蛋白的量的變化，明確該藥物的拮抗作用。在此基礎(chǔ)上，研究tau基因等多種基因的表達與變化，可進一步在基因水平上探討其發(fā)病機制和MLT的拮抗途徑，也能為篩選抗AD的其他藥物研究提供參考依據(jù)。

1 吳 琪.Alzheimer病神經(jīng)原纖維纏結(jié)tau蛋白研究〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2000;26(1):63-4.

2 吳敏霞，許 盈，謝捷明，等.褪黑素對岡田酸致NG108-15細胞tau蛋白過度磷酸化的影響〔J〕.福建醫(yī)科大學學報，2006;40(4):338-40.

3 朱粹青，曹小定.調(diào)心方藥物血清對動物阿爾茨海默病相關(guān)的tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001;21(11):834-6.