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    南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L RNA解旋酶CiDDX5的基因特征及其表達(dá)分析*

    2013-09-20 05:42:58宓妍妍黃曉航劉晨臨
    海洋科學(xué)進(jìn)展 2013年4期
    關(guān)鍵詞:解旋酶南極低溫

    宓妍妍,王 燕,黃曉航,劉晨臨*

    (1.山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南250353;2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島266061)

    DEAD-box RNA解旋酶能介導(dǎo)NTP依賴的雙鏈RNA解旋,利用ATP依賴的RNA酶催化RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化,在許多RNA參與的代謝活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DEAD-box RNA解旋酶參與RNA轉(zhuǎn)錄、前體mRNA剪切、核糖體發(fā)生、核質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)翻譯和RNA降解等重要的生命活動(dòng),廣泛存在于從病毒到人類幾乎所有已知的生命形式中[1]。

    越來(lái)越多的研究表明,DEAD-box RNA解旋酶參與植物細(xì)胞中的各種代謝過(guò)程,具有廣泛的生理意義,并且在對(duì)逆境的適應(yīng)中具有重要作用[2]。2000年,Chamot等[3]在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了一些冷誘導(dǎo)的基因,RNA解旋酶基因就是其中之一[4-7]。除溫度以外,RNA解旋酶基因還受光照、氧氣和滲透壓等條件變化的影響[8]。2005年,在擬南芥中發(fā)現(xiàn)1個(gè)DEAD-box RNA解旋酶基因發(fā)生突變,這個(gè)DEAD-box RNA解旋酶與m RNA輸出、植物發(fā)育和逆境反應(yīng)有關(guān)系[9]。集胞藻PCC6803只有1個(gè)RNA解旋酶基因,即crh R(sir0083),它的表達(dá)也受低溫誘導(dǎo),還在一定程度上受組氨酸激酶基因hik33的影響[2,7]。研究表明,crh R突變使groES,groEL1和groEL2分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄不受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[8]。RNA解旋酶可能直接或間接地影響某些酶或蛋白質(zhì)的合成,因而在生物的逆境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。

    本研究從南極分離到一株嚴(yán)格嗜冷的海冰衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L,嚴(yán)酷的極地生境造就了生活在海冰環(huán)境中的真核光合微藻(冰藻)獨(dú)特的生物學(xué)特性。在南極海冰的形成、生長(zhǎng)和融化的季節(jié)性變化中,冰藻也經(jīng)受了溫度、光照等生態(tài)條件的劇烈變化。溫度和鹽度是影響海冰中冰藻種類生存的主要因素,Chlamy domonas sp.ICE-L對(duì)低溫、高鹽等逆境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),受正常海水3倍的鹽度變化,其最適生長(zhǎng)溫度為4~10℃。目前對(duì)DEAD-box RNA解旋酶基因的研究主要集中在人類,以及玉米,水稻,藍(lán)藻和集胞藻等植物方面,對(duì)于極地浮游植物的研究還很少。

    本研究通過(guò)對(duì)篩選到的1條南極冰藻DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并研究其在低溫、高鹽環(huán)境中表達(dá)量的變化,探尋DEAD-box RNA解旋酶基因的功能,為揭示南極冰藻在低溫、高鹽環(huán)境中的適應(yīng)機(jī)制提供參考和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L分離自由中國(guó)極地研究所(上海)提供的南極中山站(69°S,77°E)附近的浮冰中。采用Provasoli培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:溫度7℃,光照強(qiáng)度1 300~1 600 lx,光照周期12 h/12 h L/D。南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的RNA解旋酶基因序列來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L EST文庫(kù),測(cè)序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。

    1.2 DEAD-box RNA解旋酶基因的生物信息學(xué)分析

    DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)分析通過(guò)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行,用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件預(yù)測(cè)蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)。通過(guò) SWISS-MODEL[10-12](http://swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站預(yù)測(cè) RNA 解旋酶基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

    將測(cè)定的CiDDX5基因序列用BLAST軟件與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的其他RNA解旋酶基因序列進(jìn)行比對(duì)。選取相似性較高的序列[13]用BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)位排列,人工校正和合并序列。用MEGA 4.0[14]軟件分析中的緊鄰法(neighbor-joining method,NJ)推測(cè)系統(tǒng)關(guān)系,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),通過(guò)自展檢測(cè)法(bootstrap test)估計(jì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可靠性,重復(fù)次數(shù)為1 000次。

    運(yùn)用DNAStar軟件將Chlamydomonas sp.ICE-L的CiDDX5基因和其它3個(gè)遺傳距離較近的綠藻DEAD-box RNA解旋酶基因進(jìn)行氨基酸序列同源性分析。

    1.3 CiDDX5基因定量表達(dá)分析

    1.3.1 樣品處理

    低溫脅迫處理,在-20℃避光條件下,將7℃培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期南極冰藻Chlamy domonas sp.ICE-L樣品分別處理0.5,1,3,6和12 h。以7℃避光處理0 h和12 h的混合樣品作為對(duì)照。

    高鹽脅迫處理,將正常海水鹽度(33)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L樣品濃縮后置于3倍海水鹽度(99)的培養(yǎng)基中,正常光照條件下分別處理0.5,1,3,6和12 h,以正常鹽度海水培養(yǎng)0 h和12 h的混合樣品作為對(duì)照。

    樣品離心收集,液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱保存。分別用液氮研磨后立即進(jìn)行RNA提取。

    1.3.2 RNA提取

    采用CTAB法[15]提取南極冰藻ICE-L的總RNA:1)將研磨好的藻樣加到600μL CTAB裂解液(2 g CTAB,1 g PVP,0.585 g EDTA,8.182 g NaCl,100 m L DEPC處理水)中,60℃水浴10 min;2)加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1,V/V),抽提兩次,4℃,13 000 rpm離心10 min;3)加入1/4體積10 mol/L的LiCl溶液,-20℃沉淀2~3 h;4)用75%乙醇洗滌沉淀兩次,加入30μL DEPC處理水溶解沉淀;5)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的濃度和OD260/OD280。

    提取出的RNA用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用于實(shí)時(shí)定量PCR。

    1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR

    根據(jù)南極冰藻ICE-L的CiDDX5基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)所需特異性引物,并由北京市理化分析測(cè)試中心代為合成。選擇磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH和核糖體蛋白R(shí)LP19這兩對(duì)基因作為本次實(shí)驗(yàn)的參比基因,引物序列見(jiàn)表1。

    在熒光定量PCR儀(Mx3000,美國(guó)Stratagene公司)上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。反應(yīng)體系為10μL,反應(yīng)程序:95℃5 min;95℃10 s,63℃20 s,72℃20 s,40個(gè)循環(huán);循環(huán)后升溫至95℃,再降至63℃,以0.5℃遞增至95℃。

    將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)值取3次重復(fù)的平均±SE,通過(guò)2-ΔΔCt方法[16]計(jì)算低溫和高鹽條件下不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)ICE-L的CiDDX5基因表達(dá)的影響。

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 The primers of Real-Time PCR

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CiDDX5基因的序列分析

    測(cè)序分析表明,CiDDX5基因全長(zhǎng)為2 077 bp,含有1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框,編碼513個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白的理論分子量為74.5 k Da,等電點(diǎn)為9.14。

    將預(yù)測(cè)的CiDDX5氨基酸序列進(jìn)行Protein Blast分析發(fā)現(xiàn)其含有DEAD-box解旋酶的保守結(jié)構(gòu)域和解旋酶超家族C端的保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。

    圖1 Blast分析CiDDX5基因可能含有的功能域DEADc:DEAD-box解旋酶的保守結(jié)構(gòu)域;HELICc:解旋酶超家族C端的保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Potential functional domains of the CiDDX5 gene by Blast analysis DEADc:DEAD-box helicase domain;HELICc:Helicase superfamily C-terminal domain

    2.2 CiDDX5基因的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

    將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其與數(shù)據(jù)庫(kù)中,來(lái)自人類的2種解旋酶Ddx5(P68)和Ddx3x的功能蛋白相似度最高。分別達(dá)到49%和41%,具有同源模建的意義。表2中a和b兩個(gè)肽段的功能分別為鎂輔因子和ATP結(jié)合位點(diǎn)。

    表2 預(yù)測(cè)CiDDX5所含兩個(gè)肽段的信息Table 2 The information of two predicted peptides of the CiDDX5

    2.3 CiDDX5氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

    從構(gòu)建的CiDDX5序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出,綠藻、高等植物和真菌分別構(gòu)成了3個(gè)獨(dú)立的分支,CiDDX5蛋白序列與萊茵衣藻,團(tuán)藻和膠球藻等綠藻的相關(guān)序列聚類在一起,說(shuō)明CiDDX5的蛋白結(jié)構(gòu)與其所屬物種的分類地位是相關(guān)的(圖2)。

    圖2 CiDDX5序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of CiDDX5 sequence constructed by the neighbor joining method

    2.4 CiDDX5氨基酸序列同源性分析

    運(yùn)用DNAStar軟件將CiDDX5氨基酸序列和3種綠藻的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì),從分析結(jié)果可看出ICE-L與萊茵衣藻,團(tuán)藻和膠球藻的同源性較高,分別為66%,65%和64%。將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列與其它3種單細(xì)胞綠藻的RNA解旋酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其編碼DEAD-box RNA解旋酶特有的9個(gè)保守的氨基酸基序(圖3),說(shuō)明CiDDX5屬于DEAD-box RNA解旋酶。但是,CiDDX5蛋白中的保守氨基酸基序與其它綠藻的DEAD-box RNA解旋酶的保守序列不完全一致。在所有9個(gè)保守基序中Motif Q的保守性最差,4種不同綠藻的Motif Q均有不同組成的氨基酸。CiDDX5的保守基序MotifⅧ是YIHRLGRTGR,其它綠藻的均為YVHRIGR。

    圖3 ICE-L CiDDX5和3種不同DEAD-box RNA解旋酶氨基酸序列同源性分析Fig.3 Amino acid sequence comparison ICE-L CiDDX5 and other representative DEAD-box RNA helicases.

    2.5 CiDDX5基因定量表達(dá)分析

    在-20℃冰凍脅迫條件下,南極冰藻經(jīng)不同時(shí)間的處理過(guò)程后,CiDDX5基因的表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化(圖4)。隨著處理時(shí)間的延續(xù),該基因的表達(dá)量逐漸升高,處理3 h時(shí),CiDDX5基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值,此時(shí)表達(dá)量為未經(jīng)低溫處理組的1.8倍,之后開(kāi)始降低;在處理12 h后,CiDDX5基因的相對(duì)表達(dá)量降為對(duì)照組的一半。

    圖4 -20℃ 低溫脅迫下CiDDX5基因的定量表達(dá)Fig.4 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under low temperature stress of-20℃

    檢測(cè)經(jīng)過(guò)3倍鹽度培養(yǎng)處理的冰藻CiDDX5基因表達(dá)量的變化,其實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果見(jiàn)圖5。在高鹽脅迫下CiDDX5基因的表達(dá)量持續(xù)升高,在6 h處理后表達(dá)量達(dá)到最大值,為對(duì)照組的2.9倍,在12 h略有降低。在所選取的處理時(shí)間段內(nèi),處理組基因的表達(dá)量都是高于對(duì)照組。表明在高鹽脅迫下,CiDDX5基因的表達(dá)量較低溫處理?xiàng)l件下發(fā)生了更為明顯和持久的變化,提示該基因在冰藻應(yīng)對(duì)高鹽脅迫方面可能發(fā)揮更重要的作用。

    圖5 3倍鹽度脅迫下ICE-L DEAD-box RNA解旋酶基因的定量表達(dá)Fig.5 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under salinity stress of 3 times

    3 討 論

    越來(lái)越多的研究表明,植物中RNA解旋酶的表達(dá)受到各種生物和非生物脅迫的影響[2,8,15-16]。在本研究中,克隆得到了南極冰藻Chlamydomnas sp.ICE-L的RNA解旋酶CiDDX5基因,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并研究了冰藻的該基因在低溫和高鹽脅迫下表達(dá)量的變化。

    解旋酶是存在于原核生物和真核生物中的一個(gè)龐大蛋白類群,分為5個(gè)(超)家族,即SF1~5。DEAD-box RNA解旋酶屬于SF2家族成員[2],根據(jù)保守的DEAD模體的序列差異分為DEAD,DEAH,DECH和DEVH類群,這些類群的蛋白中均包含特征性的保守基序結(jié)構(gòu)[2]。CiDDX5蛋白中包含了所有9個(gè)保守性模體結(jié)構(gòu),因而可以推定它是DEAD-box RNA解旋酶蛋白。DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的保守基序與其生化功能有密切關(guān)系,其中Motif V和MotifⅧ共同參與ATP的水解,而模體Ⅵ則與RNA的解鏈有關(guān)。CiDDX5中的模體V為DEAD,而模體Ⅵ為SAT,這與DEAD類群的DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的模體序列相一致。

    在植物中DEAD-box RNA解旋酶的表達(dá)受到生物以及非生物條件的影響。在低溫脅迫下Av DH1和STRS1的表達(dá)可能在早期調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮作用;而在高鹽脅迫下上述兩基因的表達(dá)可能起到長(zhǎng)期調(diào)節(jié)的作用[17-18]。從本研究中可以看出,低溫脅迫下CiDDX5基因的表達(dá)量在處理3 h時(shí)達(dá)到了最大值;而在高鹽脅迫下,在處理12 h時(shí)基因仍具有很高的表達(dá)量。以上研究結(jié)果與Liu等[19]在高等植物中所做的研究結(jié)果相一致。

    Gong等[20]發(fā)現(xiàn)在冷脅迫的條件下,DEAD-box RNA酶缺陷型的植物中,mRNA在從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程中受損。Zhu等[21]研究結(jié)果表明,RNA代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)對(duì)于植物的低溫適應(yīng)是非常重要的,DEAD-box RNA解旋酶在生理調(diào)節(jié)方面的重要作用。藍(lán)藻中DEAD-box RNA解旋酶的有關(guān)研究表明,crh R編碼的RNA解旋酶可能通過(guò)改變mRNA的構(gòu)象,影響其在低溫下的穩(wěn)定性,從而調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)水平;這種對(duì)二級(jí)構(gòu)象的調(diào)節(jié)可能是某些mRNA在低溫下指導(dǎo)蛋白合成所需要的。對(duì)擬南芥的相關(guān)研究表明,低溫脅迫下At RH25和At RH9兩種RNA解旋酶的表達(dá)都會(huì)發(fā)生上調(diào)。本研究初步揭示了CiDDX5在南極冰藻低溫、高鹽環(huán)境脅迫下表達(dá)量的變化,分析了其可能的分子作用機(jī)制。在今后的研究里,還需要進(jìn)一步對(duì)其是否是ATP依賴型、其受到脅迫的信號(hào)調(diào)節(jié)分子是什么,以及其靶向作用的m RNA的類型等方面進(jìn)行更為深入的研究,以期加深對(duì)南極冰藻RNA解旋酶的了解,進(jìn)一步揭示南極冰藻在極端環(huán)境條件下的適應(yīng)機(jī)制。

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