膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與WNT信號(hào)通路

毛星剛，章 薇，章 翔

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是人類最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤，其發(fā)生年齡較大，平均發(fā)病年齡約62歲。GBM分為原發(fā)性和繼發(fā)性，前者為原位發(fā)生，不表現(xiàn)低度病變惡性前期的征兆;后者由低級(jí)別膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)展而來。目前認(rèn)為二者具有不同的發(fā)病機(jī)制，絕大多數(shù)(95%)GBM屬于原發(fā)性，繼發(fā)性者很少見(5%)。GBM呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，瘤細(xì)胞向正常腦組織廣泛浸潤(rùn)，導(dǎo)致手術(shù)難以完全切除，且它對(duì)放、化療具有一定抵抗性，其中位生存期只有15個(gè)月左右。目前針對(duì)GBM的治療措施包括手術(shù)切除和術(shù)后輔以放、化療［1］。GBM的生長(zhǎng)特點(diǎn)使其治療后復(fù)發(fā)率較高，因而對(duì)該類腫瘤生物學(xué)特性和分子調(diào)控機(jī)制研究一直是神經(jīng)腫瘤學(xué)界的熱點(diǎn)課題。

1 GBM臨床及分子特點(diǎn)

典型GBM的MRI影像學(xué)表現(xiàn)具有不清晰的邊緣，實(shí)體部分信號(hào)不均勻(圖1)。其組織學(xué)特點(diǎn)是血管增生明顯，壞死區(qū)域細(xì)胞可形成假性柵欄樣(pseudopalisading)結(jié)構(gòu)。GBM常見的基因突變包括10 q雜合子丟失(70%)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)擴(kuò)增(36%)，p16INK4A缺失(31%)，PTEN 突變(25%)，p53突變(35%)等。近年來全基因組測(cè)序研究認(rèn)為，GBM中常見的突變主要涉及到3個(gè)信號(hào)通路［2］:①RTK/RAS/PI(3)K 通路，其突變涉及生長(zhǎng)因子受體家族(EGFR、ERBB2、PDGFRA、MET)，NF1，PTEN，RAS，PI(3)K，AKT，F(xiàn)OXO 等;②p53信號(hào)通路，其突變與 CDKN2A(ARF)，MDM2，MDM4，TP53等有關(guān);③RB信號(hào)通路，其突變與CDKN2A(P16/INK4A)，CDKN2B，CDKN2C，CDK4，CCND2，CDK6，RB1等相關(guān)。通常情況下，多數(shù)腫瘤的突變涉及到2個(gè)或2個(gè)以上的通路。

圖1 的頭顱MRI掃描腫瘤位于左額顳葉(箭頭所示)，其影像學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為不清晰的邊緣，實(shí)體部分信號(hào)不均勻

2 腫瘤干細(xì)胞

近年來，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)理論指出，腫瘤是一種異質(zhì)性組織，其中腫瘤細(xì)胞存在等級(jí)關(guān)系，一部分細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力，稱之為腫瘤干細(xì)胞，并可分化為其它非腫瘤干細(xì)胞。CSC概念最早在白血病中形成并逐漸成熟［3］，其后在多種腫瘤組織中分離出了 CSCs，包括腦腫瘤［4，5］、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌、前列腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌等。

對(duì)于CSC的理論在GBM展開了廣泛而深入的研究。許多研究表明，從膠質(zhì)瘤中可分離出類似正常神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin或CD133，并可分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等成熟細(xì)胞;這部分的少量細(xì)胞即可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤［4，6］。結(jié)合CSC理論，該類細(xì)胞被稱之為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)。目前常用的 GSC標(biāo)記物是CD133，但針對(duì)CD133能否作為GSC的標(biāo)記物尚存爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)存在一部分CD133陰性的GSCs，采用其它干細(xì)胞標(biāo)記物(如CD15)可分離出CD133 陰性的 GSC［7，8］。進(jìn)一步的研究指出，膠質(zhì)細(xì)胞瘤中CD133陽性和陰性的GSC同時(shí)存在，這些CD133陽性和陰性的GSC均可產(chǎn)生CD133陽性和陰性的子代細(xì)胞［9］，因而提出CD133雖是重要的干細(xì)胞分子，但并非特異性的GSC標(biāo)記物。

另一較常用的GSC標(biāo)記物分子是CD15，它也是NSC表面標(biāo)記物。CD15陽性的GBM細(xì)胞具有GSC特征，且CD15+細(xì)胞在體內(nèi)較CD15－細(xì)胞具有更高的致瘤性。另外，存在部分CD15+CD133－的干細(xì)胞，這些細(xì)胞同樣具有GSC的特性，包括自我更新、多分化潛能及體內(nèi)致瘤性等［7，8］。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)CD15也可作為髓母細(xì)胞瘤CSC的標(biāo)記物［10］，這提示CD15可能是多種組織中共有的干細(xì)胞標(biāo)記物。

3 GSC的分子調(diào)控機(jī)制

鑒于GSC對(duì)GBM致瘤性的重要性，對(duì)GSC生物學(xué)特征及分子調(diào)控機(jī)制的研究是目前的重要研究方向之一。GSC的干細(xì)胞狀態(tài)維持受到多個(gè)分子及信號(hào)通路的調(diào)控，這些分子及調(diào)控通路多與干細(xì)胞及多潛能性相關(guān)。多個(gè)與干細(xì)胞相關(guān)的分子在GSC呈高表達(dá)，可調(diào)控GSC的干細(xì)胞狀態(tài)，并促進(jìn)其腫瘤性質(zhì)的維持。例如GSC通常存在于一個(gè)缺氧環(huán)境之中［11～13］，缺氧誘導(dǎo)因子是GSC維持干性(stemness)的重要調(diào)節(jié)分子［13］;ZNF217作為分化抑制因子可促進(jìn)干細(xì)胞狀態(tài)的維持，其在GSC高表達(dá)并可促進(jìn)GSC的致瘤性［12］。目前發(fā)現(xiàn)越來越多的干細(xì)胞相關(guān)因子與GSC的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)維持和/或致瘤性有關(guān)，包括 SOX2、BMI1、EZH2、MET、PLAGL2、ID1等［14］。另外，與干細(xì)胞自我更新及增殖有密切關(guān)系的信號(hào)通路參與了GSC的干性維持及致瘤性，包括 TGF－β、Notch、Sonic Hedgehog、EGFR、WNT、Stat3、BMP 等［15，16］。這些結(jié)果表明，促進(jìn)干細(xì)胞維持及細(xì)胞增殖的分子或信號(hào)通路活性在GSC中明顯增高。一些研究指出，WNT通路的激活對(duì)維持GSC的腫瘤干細(xì)胞特征和致瘤性至關(guān)重要。因此，深入研究這些分子和通路對(duì)GSC的影響，將為進(jìn)一步了解GSC的生物學(xué)特征、制定新的治療策略提供明確的方向。

4 WNT信號(hào)通路

WNT通路是細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育的重要通路［17，18］。在發(fā)現(xiàn) WNT 與腫瘤關(guān)系之前，有關(guān) WNT功能研究主要集中在發(fā)育方面(與生物體節(jié)發(fā)育的關(guān)系)。WNT的名稱來源是兩個(gè)同源基因Int(integration 1)和Wg(Wingless)的合稱，這兩個(gè)基因最初發(fā)現(xiàn)分別與小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及果蠅的翅膀發(fā)育有關(guān)。之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了WNT經(jīng)典通路各個(gè)部分的分子，包括 WNT配體、Frizzled(FZD)受體、LRP共受體、降解復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子β－Catenin和TCF/LEF等［17，18］。此外，WNT 還可通過不依賴于 β －Catenin的非經(jīng)典通路(平面細(xì)胞極化通路和鈣離子相關(guān)通路)發(fā)揮作用。

WNT信號(hào)通路是干細(xì)胞維持的關(guān)鍵通路之一［17，18］。WNT 不僅在多潛能干細(xì)胞、NSCs、造血干細(xì)胞等多種干細(xì)胞的多潛能性中起到關(guān)鍵作用，且在多種腫瘤的發(fā)生及CSC的致瘤性中亦起重要作用［18］。經(jīng)典的WNT通路起始于配體與膜受體的結(jié)合，WNT配體分子(WNT3、WNT5A等)與受體(Frizzled，F(xiàn)ZD1，F(xiàn)ZD7，F(xiàn)ZD2，F(xiàn)ZD4 等)結(jié)合之后，可激活下游通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子β－Catenin穩(wěn)定并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，最終通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)眾多靶基因的表達(dá)。WNT受體未激活時(shí)，β－Catenin位于細(xì)胞漿內(nèi)，并與骨架蛋白APC、Axin、激酶CKI和GSK3β形成復(fù)合物。在此復(fù)合物內(nèi)，激酶CKI和GSK3β可降解β－Catenin。WNT配體與Frizzled受體家族及LRP5/6/arrow共受體結(jié)合后，APC/Axin/CK1/GSK3β降解復(fù)合活性受到抑制，從而釋放出β－Catenin，使其在細(xì)胞質(zhì)中聚集并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用而激活下游基因的表達(dá)。在β－Catenin未進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于WNT靶基因、并抑制其表達(dá)。β－Catenin與TCF/LEF的結(jié)合提供了一個(gè)激活結(jié)構(gòu)域，這樣可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的激活。

WNT的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子及受體是LGR孤受體家族(LGR4、LGR5和 LGR6)及其配體 R－spondin(Rspo)蛋白(包括 RSPO1－4)［17，18］。LGR5是重要的干細(xì)胞標(biāo)記物，在多種組織及腫瘤發(fā)生(包括膠質(zhì)細(xì)胞瘤)中發(fā)揮重要作用［17～20］。LGR5可直接與FZD及LRP受體復(fù)合物作用，當(dāng)RSPO蛋白與LGR受體結(jié)合后，對(duì)FZD及LRP受體復(fù)合物產(chǎn)生影響，可增加WNT通路的活性，從而起到調(diào)節(jié)WNT 通路活性的作用［17，18］。

與大多數(shù)信號(hào)通路相類似，WNT通路的激活起始于受體復(fù)合物空間構(gòu)象的變化［18］。大多數(shù)信號(hào)通路的激活過程多由逐級(jí)放大的傳導(dǎo)信號(hào)構(gòu)成(如激酶)。而WNT信號(hào)則不同，由于其激活的過程需要將負(fù)性調(diào)節(jié)因子Axin從降解復(fù)合物中分離出來，因而，其信號(hào)的激活過程呈現(xiàn)為滴度依賴性，而非逐級(jí)放大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［18］。WNT的這一特點(diǎn)，也決定了其信號(hào)傳導(dǎo)過程調(diào)節(jié)的精密性與復(fù)雜性。

5 WNT通路在GSC中的調(diào)節(jié)作用

WNT通路在干細(xì)胞及發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，它與腫瘤的關(guān)系，早期較明確的發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌［17，18］。在正常細(xì)胞中，其通路活性受到多個(gè)水平及分子的嚴(yán)密調(diào)控，從而確保正常細(xì)胞增殖與分化的動(dòng)態(tài)平衡。而在腫瘤細(xì)胞中，WNT通路的某一調(diào)控環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖與分化的不平衡。WNT活性分子的過表達(dá)或激活突變、WNT抑制因子的失活或失活突變，均會(huì)使WNT通路不恰當(dāng)激活，致使細(xì)胞異常增殖而發(fā)生腫瘤。絕大多數(shù)結(jié)腸－直腸癌患者具有WNT抑制因子APC的失活［21］。作為β－Catenin降解復(fù)合物的重要成員，APC失活可導(dǎo)致β－Catenin穩(wěn)定性增加，使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物而激活下游基因。由于WNT通路對(duì)腫瘤發(fā)生及干細(xì)胞的重要性，近年來，越來越多的研究證明，WNT通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生及GSC的干性維持等多方面發(fā)揮了積極作用［22～24］。

首先，WNT通路中的多個(gè)正性及負(fù)性調(diào)節(jié)因子在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)異常，提示W(wǎng)NT的異常激活。WNT信號(hào)通路的關(guān)鍵下游轉(zhuǎn)錄因子β－Catenin在GBM 中表達(dá)增高［25，26］，且其高表達(dá)患者預(yù)后差［26］。WNT通路激活過程中，β－Catenin在向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)入過程依賴于另外一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1，而FoxM1也高表達(dá)于GBM，且其細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)水平與β－Catenin呈正相關(guān)［23］。此外，WNT通路中的多個(gè)活性分子均在GBM中高表達(dá)，包括配體分子WNT1、WNT2［25］、WNT3A［27］、WNT5 a［25，28］，受 體 分 子FZD2［25］、FZD4［29］、FZD9［30］，WNT 正性調(diào)節(jié)分子FRAT1等。同時(shí)，WNT通路的很多負(fù)性調(diào)節(jié)分子在GBM中表達(dá)降低或有啟動(dòng)子區(qū)甲基化，故可促進(jìn)WNT通路的激活 (如 DKK1、SFRP1、WIF1等)［31，32］。

第二，WNT通路中的多個(gè)分子(如正性和負(fù)性調(diào)節(jié)分子)，可影響GSC的多方面生物學(xué)特性。抑制WNT配體分子WNT1、WNT3A可抑制GSC增殖、遷徙能力及其化療的抵抗性，并可抑制其體內(nèi)致瘤性［27］。沉默 WNT2、WNT3A 及 WNT5可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖及體內(nèi)活性，且它們還可通過PI3K/AKT 通路發(fā)揮作用［25，28］。WNT 受體 FZD4 及與FZD蛋白相關(guān)作用的分子DVL，亦系促進(jìn)GSC腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)、侵襲性及體內(nèi)致瘤性的重要分子［29，33］，并可促進(jìn) GSC 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－to－mesenchymal transition，EMT)調(diào)節(jié)分子的表達(dá)(如 SNAI1、ZEB1、Twist、N－Cadherin 等)［29，34］。影響β－Catenin/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物活性的分子PYGO2，也是調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖的重要分子，其可調(diào)節(jié) WNT 靶基因 cyclin D1(CCND1)［35］。WNT 通路的另一正性調(diào)節(jié)分子FRAT1也是促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖、侵襲及致瘤性的重要分子［36］。調(diào)節(jié)WNT通路活性的干細(xì)胞因子 LGR5也參與調(diào)節(jié)GSC的腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)［19，20］。對(duì)于GBM中表達(dá)降低的WNT抑制分子WIF1、DKK1等，在GSC及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中過表達(dá)此類分子時(shí)，可促進(jìn)WNT通路的激活，并抑制GSC的干性及致瘤性［37，38］。值得注意的是，WIF1可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的老化，且WIF1抑制GBM細(xì)胞致瘤性及促進(jìn)其老化的效果是有劑量依賴性的［38］，符合WNT通路激活的滴度依賴性質(zhì)［18］。WNT通路也是參與GSC放、化療抵抗性的重要信號(hào)通路［27，39］。

第三，WNT通路可與多個(gè)信號(hào)通路及GSC調(diào)節(jié)分子相互作用，在腫瘤能量代謝、表觀遺傳學(xué)修飾等之間有著密切聯(lián)系，并參與對(duì)GSC致瘤性的調(diào)節(jié)。WNT信號(hào)通路具有廣泛的作用，其在GBM尚可受到其它多個(gè)分子或信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如AURKA通過增加β－Catenin的穩(wěn)定性促進(jìn)GSC的干性維持及致瘤性［40］;WNT可作為癌基因MET的下游通路促進(jìn)GSC的干性維持及致瘤性［41］;癌基因Moesin可與WNT/β－Catenin相互作用促進(jìn)GSC的致瘤性［42］。ASCL1可通過抑制DKK1加強(qiáng)WNT通路的激活，從而促進(jìn)GSC的腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)和致瘤性［43］。WNT還與其它信號(hào)通路之間有密切的相互作用，如EGFR通路激活可促進(jìn)β－Catenin聚集并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，促進(jìn) WNT靶基因表達(dá)(如CCND1)［44］。EGFR 對(duì) β －Catenin發(fā)揮作用的效果是通過促進(jìn)PKM2向核內(nèi)轉(zhuǎn)移而達(dá)到的［44］。PKM2是參與腫瘤能量代謝(Warburg effect)的關(guān)鍵分子，在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。PKM2可與組蛋白H3直接作用導(dǎo)致其T11的磷酸化，隨之促使HDAC3從CCND1、MYC等靶基因的啟動(dòng)子區(qū)解離出來，以及組蛋白H3的K9位乙酰化，進(jìn)而激活靶基因表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的增殖與致瘤性。

6 展望

WNT通路的多成分分子在GBM及GSC中表達(dá)異常，且促進(jìn)WNT激活的分子在GBM及GSC中高表達(dá)，可增進(jìn)GSC的腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)及致瘤性;同樣，WNT通路抑制分子可抑制GSC的致瘤性。WNT與其它通路及干細(xì)胞相關(guān)分子之間的廣泛作用，進(jìn)一步提示W(wǎng)NT在GSC的中的重要性。這表明WNT通路是抑制GSC、治療GBM的重要靶點(diǎn)。由于WNT通路組成及功能的復(fù)雜性，進(jìn)一步深入探索WNT在GBM及GSC中的作用及機(jī)制，以及WNT與其它通路之間的相互關(guān)系，將為理解GBM發(fā)病機(jī)制、制定以WNT通路為靶點(diǎn)的措施提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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