抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸黏膜形態(tài)結構及免疫活性細胞數量的影響

劉莉如 楊開倫 滑 靜 王曉霞 劉亭婷

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052;2.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206;3.首都師范大學，北京 100048)

當前，細菌性感染和細菌性疾病呈上升趨勢，耐藥性細菌，如耐藥性結核桿菌、大腸桿菌和被稱為“超級細菌”耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等對人和動物造成的危害日趨嚴重，這種現狀急需改善，而抗菌肽(antimicrobial peptides，ABPs)對細菌具有強烈的抑制作用，在飼料中長期添加抗菌肽，細菌不易獲得耐藥性，使用效果穩(wěn)定，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型飼料添加劑?？梢酝ㄟ^向海蘭褐仔公雞基礎飼糧中添加天蠶素抗菌肽(cecropin)，達到徹底替代飼用抗生素的使用的目的，對降低抗生素殘留，生產綠色、安全、營養(yǎng)的畜禽產品，促進健康養(yǎng)殖的發(fā)展具有重要意義。前人對抗菌肽的研究主要集中在分離純化、鑒定、抗微生物活性等方面，在動物生產方面，尤其在海蘭褐仔公雞黏膜免疫方面的研究，目前罕見報道。有關在飼糧中分別添加適量抗生素和不同水平抗菌肽，研究兩者對海蘭褐仔公雞各試驗指標的影響，進一步比較畜禽飼糧中抗菌肽與抗生素的添加效果，進而確定適宜添加量的文獻更是鮮見。為此，本文旨在通過在海蘭褐仔公雞飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽，研究其對小腸黏膜形態(tài)結構、免疫活性細胞數量的影響，為進一步研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用天蠶素抗菌肽主要成分為枯草芽孢桿菌，含量≥1×109CFU/g，由國家飼料工程技術研究中心研制，北京中農穎泰生物技術有限公司生產。試驗所用抗生素為金霉素。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗選用336只1日齡海蘭褐仔公雞(購自北京農業(yè)職業(yè)技術學院種雞場)，平均體重為(39.14±0.17)g，3層籠養(yǎng)。飼喂期內，試驗雞只自由采食飲水，其他免疫和消毒措施遵照雞場正常程序進行，每天觀察雞群健康狀況，并記錄試驗數據。飼養(yǎng)試驗在中國農業(yè)科學院南口中試基地雞舍進行。

1.3 試驗分組設計

將試驗選用的336只1日齡健康海蘭褐仔公雞隨機分為7個處理(表1)，每個處理4個重復，每個重復12只雞，各處理初始體重差異不顯著(P＞0.05)。飼養(yǎng)試驗期為42 d。

1.4 試驗飼糧

以玉米-豆粕型飼糧為基礎飼糧，飼糧按雞飼養(yǎng)標準(NY/T 33—2004)配制。

表1 試驗設計Table1 Experimental design

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.5 組織切片制作方法

組織切片制作方法為:1)取材及固定;2)修塊;3)脫水、硬化;4)透明;5)浸蠟;6)包埋;7)塑型和切片;8)展片;9)烘片;10)染色。

1.6 常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)組織染色程序流程

常規(guī)HE組織染色程序流程為:1)組織切片常規(guī)脫蠟[二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯∶無水乙醇(1∶1)，5 min];2)無水乙醇和梯度酒精下行(無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ，5 min→95%、80%、70%酒精，2 min);3)蘇木精染色，6 min;4)蒸餾水漂洗，1 min;5)1%鹽酸酒精分色，5 s;6)自來水藍化，25 min;7)伊紅染色，3 s;8)梯度酒精上行(70%、80%酒精，2 min)，95%酒精、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ，5 min;9)透明[二甲苯∶無水乙醇(1∶1)、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，5 min];10)封固為中性樹膠封片。

1.7 糖原及多糖高碘酸-Schiff氏液(PAS)染色程序流程

PAS染色程序流程為:1)石蠟組織切片，常規(guī)脫蠟程序同HE組織染色程序流程1)～2)步驟;2)蒸餾水過洗2次;3)高碘酸氧化液處理10 min;4)充分蒸餾水洗;5)Schiff氏液染色10 min;6)流水沖洗30 s至2 min，對于著色較深的切片可適當縮短時間;7)用Mayer明礬-蘇木精液染細胞核3～5 min;8)0.5%鹽酸乙醇液分化30 s;9)自來水浸洗2 min;10)無水乙醇Ⅰ，5 min;11)無水乙醇Ⅱ，5 min;12)二甲苯∶無水乙醇(1∶1)，5 min;13)二甲苯Ⅰ，5 min;14)二甲苯Ⅱ，5 min;15)封固為中性樹膠封片。

待中性樹脂干燥后，用光學顯微鏡進行觀察。觀察海蘭褐仔公雞小腸黏膜基本形態(tài)結構;其中，HE染色觀察腸黏膜上皮內淋巴細胞，PAS染色觀察杯狀細胞。

1.8 組織切片讀取方法

在OLYMPUS生物顯微鏡10倍光學顯微鏡下進行石蠟切片的觀察、取圖，在組織切片上選取典型視野進行拍照，使用Motic 2.0通用圖像分析軟件測量小腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度以及肌層厚度，觀察和測量海蘭褐仔公雞十二指腸、空腸和回腸上皮內淋巴細胞、杯狀細胞的分布和數量。

1.9 數據處理及統(tǒng)計分析

利用Excel軟件對各重復原始數據進行處理，采用SPSS 17.0軟件ANOVA進行顯著性分析，并采用Duncan氏法進行多重比較。測定結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸黏膜形態(tài)結構的影響

由圖1可以看出，經HE染色后，光鏡下觀察，添加量為350 mg/kg的抗菌肽Ⅴ組海蘭褐仔公雞小腸黏膜結構較為完整，層次分明，腸黏膜上皮表面的紋狀緣結構清晰，腸絨毛排列較緊密。腸黏膜上皮細胞輪廓清晰，排列緊密，染色鮮明。柱狀細胞呈高柱狀，單層排列，胞漿豐富，胞核橢圓形，位于細胞基部。杯狀細胞呈現高腳杯狀，分散在柱狀細胞之間。而對照組的黏膜結構不夠完整，偶見腸絨毛頂端脫落現象，有的絨毛較細，尤其是十二指腸。

圖1 抗菌肽Ⅴ組空腸黏膜形態(tài)結構顯微照片Fig.1 Photomicrographs of mucosal morphology of jejunum in ABPs groupⅤ

2.1.1 抗菌肽對海蘭褐仔公雞十二指腸黏膜形態(tài)結構的影響

由表3可以看出，隨著飼糧中天蠶素抗菌肽添加量的不斷增加，十二指腸絨毛高度呈現升高趨勢，其中抗菌肽Ⅴ組十二指腸絨毛高度顯著高于對照組、抗生素組、抗菌肽Ⅰ組(P＜0.05)，與對照組、抗生素組相比分別提高了24.88%和19.52%?？咕蘑?、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間絨毛高度不存在顯著性差異(P＞0.05)。

十二指腸隱窩深度各處理之間不存在顯著性差異(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組十二指腸黏膜厚度顯著高于其他各處理(P＜0.05)，分別比對照組提高了15.83%、25.74%，而其他各處理之間不存在顯著性差異(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組十二指腸肌層厚度顯著高于對照組、抗生素組(P＜0.05)，抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組和抗生素組與對照組差異不顯著(P＞0.05)，各抗菌肽組之間同樣差異不顯著(P＞0.05)。但抗菌肽Ⅴ組肌層厚度數值最高，比對照組提高了64.98%，比抗生素組提高了37.43%。

2.1.2 抗菌肽對海蘭褐仔公雞空腸黏膜形態(tài)結構的影響

由表4可以看出，抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組空腸絨毛高度與對照組、抗菌肽Ⅰ組差異顯著(P＜0.05)，與對照組相比，分別提高了19.51%、24.08%，但與抗生素組差異不顯著(P＞0.05)?？咕蘑蠼M顯著高于對照組(P＜0.05)，但與抗生素組也差異不顯著(P＞0.05)。抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間同樣不存在顯著性差異(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組空腸隱窩深度顯著低于對照組、抗菌肽Ⅰ組(P＜0.05)，與抗生素組不存在顯著性差異(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間同樣差異不顯著(P＞0.05)。

抗生素組及抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組空腸黏膜厚度均顯著高于對照組(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組也顯著高于抗生素組和其他抗菌肽組(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅴ組又顯著高于抗菌肽Ⅳ組(P＜0.05)。

空腸肌層厚度各處理之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 抗菌肽對仔公雞十二指腸黏膜形態(tài)結構的影響Table3 Effects of ABPs on mucosal morphology of duodenum of young roosters μm

表4 抗菌肽對仔公雞空腸黏膜形態(tài)結構的影響Table4 Effects of ABPs on mucosal morphology of jejunum of young roosters μm

2.1.3 抗菌肽對海蘭褐仔公雞回腸黏膜形態(tài)結構的影響

由表5可以看出，抗菌肽Ⅴ組回腸絨毛高度顯著高于對照組、抗菌肽Ⅰ組(P＜0.05)，比對照組提高了13.31%，但與抗生素組之間不存在顯著性差異(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ組回腸隱窩深度顯著低于對照組(P＜0.05)，且與抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組差異顯著(P＜0.05)，與抗生素組不存在顯著性差異(P＞0.05)，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間同樣差異不顯著(P ＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ組回腸黏膜厚度顯著高于對照組、抗菌肽Ⅰ組(P＜0.05)，比對照組提高了20.86%，但與抗生素組之間不存在顯著性差異(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間差異也不顯著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組回腸肌層厚度顯著高于對照組(P＜0.05)，分別比對照組提高了46.23%、52.60%，與抗生素組差異不顯著(P＞0.05)，且各抗菌肽組之間不存在顯著性差異(P＞0.05)，但肌層厚度有逐漸升高的趨勢。

表5 抗菌肽對仔公雞回腸黏膜形態(tài)結構的影響Table5 Effects of ABPs on mucosal morphology of ileum of young roosters μm

2.2 抗菌肽對海蘭褐仔公雞黏膜免疫相關細胞數量的影響

2.2.1 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸上皮內淋巴細胞數量及分布的影響

HE染色結果顯示，海蘭褐仔公雞十二指腸、空腸(圖2)、回腸絨毛上均有上皮內淋巴細胞分布。上皮內淋巴細胞多位于上皮細胞基側膜附近，少數位于上皮核層和頂層，以小型細胞為主，核大，呈圓形，深染，胞漿少。固有層內也有淋巴細胞分布。

圖2 抗菌肽Ⅴ組空腸上皮內淋巴細胞形態(tài)結構顯微照片Fig.2 Photomicrographs of morphology of intraepithelial lymphocytes in jejunum in ABPs groupⅤ

由表6可以看出，各抗菌肽組十二指腸上皮內淋巴細胞數量與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗菌肽Ⅱ組(P＜0.05)，與抗生素組之間不存在顯著性差異(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ組空腸上皮內淋巴細胞數量顯著高于對照組(P＜0.05)，而與抗生素組差異不顯著(P＞0.05)，各抗菌肽組之間差異不顯著(P＞0.05)，但上皮內淋巴細胞數量有逐漸增多的趨勢。

回腸上皮內淋巴細胞數量各處理之間差異不顯著(P＞0.05)。

上皮內淋巴細胞以小型細胞為主，胞核大而圓，深染，胞漿少。腸段不同，上皮內淋巴細胞數量差異很大。

由表6可以看出，海蘭褐仔公雞十二指腸上皮內淋巴細胞數量最多，空腸次之，回腸則數量最少。

2.2.2 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸杯狀細胞數量的影響

抗菌肽Ⅴ組空腸杯狀細胞形態(tài)結構顯微照片見圖3。PAS染色呈桃紅色陽性反應，杯狀細胞分布于腸絨毛上皮細胞間，高腳杯狀，頂部胞質為大量糖原顆粒擁塞而膨隆，底部纖細，有小而深染的不規(guī)則核與少量嗜堿性胞質。不同的腸段杯狀細胞的數量也有所不同。杯狀細胞的數量從十二指腸到回腸呈逐漸增多趨勢。

由表7可以看出，抗菌肽Ⅴ組十二指腸杯狀細胞數量顯著高于對照組和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)，與抗生素組差異不顯著(P＞0.05)?？咕蘑?、Ⅳ、Ⅴ組之間差異不顯著(P＞0.05)，但杯狀細胞數量有逐漸增多趨勢。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組空腸杯狀細胞數量顯著高于對照組(P＜0.05)，抗菌肽Ⅴ組又顯著高于抗生素組和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組回腸杯狀細胞數量顯著高于對照組和抗生素組(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)。

表6 抗菌肽對仔公雞小腸上皮內淋巴細胞數量的影響Table6 Effects of ABPs on the number of intraepithelial lymphocytes in small intestine of young roosters 個

圖3 抗菌肽Ⅴ組空腸杯狀細胞形態(tài)結構顯微照片Fig.3 Photomicrographs of morphology of goblet cells in jejunum in ABPs groupⅤ

3 討論

3.1 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸黏膜形態(tài)結構的影響

小腸是碳水化合物、脂肪、蛋白質等主要營養(yǎng)物質消化吸收的重要場所，小腸內黏膜結構與功能的完整性是養(yǎng)分消化吸收、動物正常生長和生產的基本保證，若腸黏膜發(fā)育不良或受損將嚴重影響動物的生長、發(fā)育及免疫功能等，所以維持正常的小腸結構與功能尤為重要。

絨毛形態(tài)的變化直接影響絨毛的表面積，進而影響機體吸收營養(yǎng)物質的能力。小腸絨毛變長、變粗或排列緊密會使小腸接觸營養(yǎng)物質的面積增大，有利于微生物的定植和對營養(yǎng)物質的利用，從而促進小腸消化和吸收。微生物及其代謝產物能夠引起腸壁厚度的增加，使更多的固有膜延伸到腸絨毛中央[1-2]。絨毛變短時，成熟的絨毛細胞減少，對養(yǎng)分的吸收能力低[3]，腸絨毛強勁有規(guī)律的擺動也有助于排斥有害菌群的定植。隱窩，即腸腺，是由絨毛基部的上皮陷入固有層內形成的管狀腺體，隱窩內未分化細胞是絨毛細胞的再生來源，隱窩基部不斷有細胞向絨毛頂部遷移、分化，形成具有吸收功能的絨毛細胞，以補充絨毛上皮的正常脫落，而隱窩深度則反映了細胞生成率。如果此過程減慢，則基部的細胞生成率降低，隱窩變淺。因而隱窩的深淺對保持腸絨毛的完整形態(tài)和正常機能有重要作用[4]，而黏膜的厚薄與營養(yǎng)物質的吸收和轉運過程有關，由此影響小腸的吸收功能。Caspary[5]報道指出，絨毛高度增加后會使小腸接觸營養(yǎng)物質的面積增大，從而增強小腸對營養(yǎng)物質的吸收。康靜靜等[6]研究結果表明，非洲鴕鳥皮膚抗菌肽可增強雛雞的的消化吸收功能，從而促進雛雞的生長發(fā)育以及改善雛雞盲腸黏膜結構。Bao等[7]研究了豬抗菌肽(PABP)對肉仔雞生產性能和腸道免疫的影響，結果表明，PABP處理的肉仔雞體重和日增重顯著增加，腸黏膜深度和厚度顯著增加，血清堿性磷酸酶活性顯著提高，血清分泌型免疫球蛋白A(SIgA)比例顯著增加。本試驗結果表明，除十二指腸隱窩深度、空腸肌層厚度各處理之間無顯著性差異外，飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽可不同程度地提高海蘭褐仔公雞小腸黏膜絨毛高度、黏膜厚度和肌層厚度以及降低隱窩深度，從而有效改善了其小腸黏膜結構。

表7 抗菌肽對仔公雞小腸杯狀細胞數量的影響Table7 Effects of ABPs on the number of goblet cells in small intestine of young roosters 個

3.2 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸上皮內淋巴細胞數量的影響

作為腸道屏障的重要組成部分，腸黏膜機械屏障包括黏膜上皮、上皮之間的連接結構、上皮的基膜、細胞表面的細胞。上皮內淋巴細胞是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細胞，位于腸絨毛上皮細胞之間，在上皮內15%的細胞為淋巴細胞，上皮內淋巴細胞在腸道黏膜屏障中發(fā)揮重要的作用。馬衛(wèi)明[8]研究結果表明，豬小腸抗菌肽可以增加雛雞腸道內上皮內淋巴細胞的數量，試驗組雞十二指腸、空腸和回腸上皮內淋巴細胞數量顯著高于對照組。本試驗結果表明，適量天蠶素抗菌肽可以增加蛋用仔公雞十二指腸上皮內淋巴細胞數量，抗菌肽Ⅴ組空腸上皮內淋巴細胞數量顯著高于對照組，各處理之間回腸上皮內淋巴細胞數量差異不顯著，但隨著天蠶素抗菌肽添加量的增加，其數量亦有逐漸增加的趨勢，這與上述研究結果基本一致。另外本試驗研究發(fā)現海蘭褐蛋用仔公雞十二指腸上皮內淋巴細胞數量最多，空腸次之，回腸則數量最少。

3.3 抗菌肽對海蘭褐仔公雞小腸杯狀細胞數量的影響

杯狀細胞能分泌黏液，對腸黏膜上皮可起到潤滑保護和清除廢物的作用，杯狀細胞還可合成三葉狀蛋白，通過聚合黏性糖蛋白來保護上皮細胞免受外部損害，以此加強宿主的防御能力，是構成腸道機械屏障的結構之一。馬衛(wèi)明[8]試驗結果表明豬小腸抗菌肽可以顯著提高雞腸道組織杯狀細胞的數量，增強雞腸道黏膜機械屏障功能，提高雞的腸道黏膜免疫能力。本試驗結果表明，與對照組相比，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組可顯著提高海蘭褐仔公雞十二指腸、空腸及回腸各腸段杯狀細胞數量，這與上述研究結果是一致的，表明天蠶素抗菌肽有效增強了宿主的防御能力。

4 結論

①除十二指腸隱窩深度、空腸肌層厚度各處理之間無顯著性差異外，各抗菌肽組各腸段(十二指腸、空腸、回腸)絨毛高度、黏膜厚度、肌層厚度均得到了不同程度的提高，隱窩深度得到了不同程度的降低?？咕蘑踅M空腸上皮內淋巴細胞數量顯著升高?？咕蘑蟆ⅱ?、Ⅴ組十二指腸、空腸及回腸杯狀細胞數量顯著升高。

②綜合各指標來看，以抗菌肽Ⅴ組添加效果最好，天蠶素抗菌肽添加量為350 mg/kg。

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