擬南芥MYB51轉(zhuǎn)錄因子對(duì)芥子油苷代謝的調(diào)控作用

李 晶，蒿連梅，王洪波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

芥子油苷（Glucosinolate）是一類含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于十字花科植物中，由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團(tuán)以及來(lái)源于氨基酸的側(cè)鏈R基組成。根據(jù)側(cè)鏈氨基酸來(lái)源的不同，芥子油苷分為來(lái)源于甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的脂肪族芥子油苷，來(lái)源于色氨酸的吲哚族芥子油苷、來(lái)源于苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族芥子油苷。芥子油苷及其水解產(chǎn)物具有多種不同的生物活性，可參與植物對(duì)病原菌、昆蟲侵害等生物脅迫的防御性反應(yīng)[1-4]。研究表明某些脂肪族芥子油苷具有抗癌活性，是迄今在植物中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗癌活性物質(zhì)[5-8]。近年來(lái)關(guān)于芥子油苷代謝調(diào)控的研究已成為植物次生代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

擬南芥中MYB51轉(zhuǎn)錄因子是一類R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)控吲哚族芥子油苷的代謝。當(dāng)擬南芥受到外源病菌侵染時(shí)，MYB51轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)增加吲哚族芥子油苷含量參與植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)[9-10]。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)MYB51基因后，吲哚族芥子油苷含量升高，對(duì)廣食性鱗翅目類昆蟲甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）與粉文夜蛾（Trichoplusia ni）也表現(xiàn)出一定的防御性[11]。Clay等發(fā)現(xiàn)吲哚族芥子油苷的降解產(chǎn)物參與病原菌誘導(dǎo)的細(xì)胞壁胼胝脂累積，從而使植物獲得廣譜抗病性[12]。水楊酸與茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)途徑與植物抗病性防御反應(yīng)密切相關(guān)[13-14]。研究表明，擬南芥葉片受到病原菌侵染后，芥子油苷種類和含量發(fā)生顯著變化，且有可能通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)[15]。

為深入了解MYB51對(duì)不同結(jié)構(gòu)芥子油苷合成代謝的調(diào)控及芥子油苷參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能性，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入擬南芥，采用RT-PCR方法，系統(tǒng)分析吲哚族芥子油苷合成酶基因、脂肪族芥子油苷合成酶基因以及水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)記基因表達(dá)變化。研究結(jié)果初步揭示了MYB51轉(zhuǎn)錄因子在芥子油苷代謝途徑中的調(diào)控作用，MYB51可以促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，但同時(shí)抑制脂肪族芥子油苷的合成，對(duì)兩種不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的芥子油苷的相對(duì)比例起協(xié)調(diào)作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)記基因變化說(shuō)明吲哚族芥子油苷可能直接或間接參與茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可為MYB51轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)芥子油苷代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型）種子4℃春化3 d后播種于由蛭石與黑土比例為1∶1的土中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度23℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度7 000 lx，光照長(zhǎng)度16 h·d-1。

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404等材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物次生代謝研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 MYB51基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)

1.2.1.1 MYB51基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

取生長(zhǎng)三周的擬南芥幼嫩葉片，采用Trizol（Invitrogen）試劑按照產(chǎn)品說(shuō)明書提取總RNA。以總RNA為模板，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)li?go dT為引物合成cDNA第一條鏈，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MYB51基因的編碼序列。引物序列為 5'ggcttaaUATGGTGCGGACACCGTGT3'和 5'ggtt?taaUTCATCCAAAATAGTTATCAATTTCG 3'。

以pCAMBIA230035Su載體為基礎(chǔ)[16]，經(jīng)PacⅠ和Nt.BbvCIB酶切后，將上述克隆獲得的MYB51基因片段連入植物表達(dá)載體，構(gòu)建成由組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體。

1.2.1.2 MYB51基因?qū)M南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

將上述獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)測(cè)序證明所獲得DNA序列準(zhǔn)確無(wú)誤后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥[17]，用含有50 mg·L-1卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選抗性植株?？剐灾仓暌圃运闹芎蠓謩e提取DNA和RNA，進(jìn)行外源基因整合的PCR鑒定和目的基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)。

1.2.1.3 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因整合情況的分子鑒定

取擬南芥T1代抗性植株葉片，用DNA提取試劑盒（Easy pure plant genomic DNA extraction kit）提取基因組DNA。為避免擬南芥內(nèi)源MYB51基因的干擾，采用MYB51基因特異性引物和植物表達(dá)載體特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列為：5'TT?GCGATAAAGGAAAGGC3'和 5'TCATCCAAAA TAGTTATCAATTTCG 3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 308 bp。

1.2.1.4 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51表達(dá)水平的檢測(cè)

取上述PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株葉片，用RNA prep Plant Kit試劑盒提取樣品的總RNA，以TaKa?Ra反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第一條鏈，以5'TCTGTCTGAGATTATCGGAAGTGG 3'和5'CCAACGAAATTATCGCAGTACATTAG 3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度為270 bp。

內(nèi)參基因ACTIN2的RT-PCR引物為5'CCATC CTCCGTCTTGACCTT3'和5'ACTTGCCCATCGGGT AATTC 3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約200 bp。

1.2.2 過(guò)量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)分析

分別取生長(zhǎng)六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。對(duì)幾種主要的吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。CYP79A2的引物為5'CGATGGGCACGGAGTACTG 3'和5'CAAAGG CGTAAAGATGGGTTAA 3'；CYP79B2的引物為5'ACCGTAGAAGATGTAGAGCACATG 3'和5'GCTC CTTAATGGTGGGTTTGATT 3'；CYP79B3 的引物為5'GTGGACCGACTTTGGAAGATATC 3'和5'CGGC TTTGATGGGTTGTCT 3'；CYP83B1的引物為5'GAAAGGGCAACAAACCATGTC 3'和5'GGTTGTA AGGAATCCGAAATAA 3'。

1.2.3 過(guò)量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)分析

分別取生長(zhǎng)六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。對(duì)幾種主要的脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。CYP79F1的引物為5'AAGCGGATAATCTCATAGCTTACG 3'和5'CC AATCTTCAACAGCAGCCTTA 3'；CYP79F2 的 引 物為5'TGGTTAGGTGGTTGGAATATTGA 3'和5'CCC AAGGGTGGTATCTTGACG 3'。

1.2.4 過(guò)量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中水楊酸與茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因的表達(dá)分析

分別取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。分別對(duì)水楊酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因PR1、PR2與茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因PDF1.2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。PR1的引物為5'TTCACAACCAGGCAC?GAGG 3'和 5'TGTTACACCTCACTTTGGCACAT 3'；PR2的引物為5'GGCTCTTTACAAACAACAAAA?CATC 3'和5'TCTTATACTCATCCCTGAACCTTCC 3'；PDF1.2 的引物為 5'ATGGCTAAGTTTGCTTC?CATCA 3'和 5'TTAACATGGGACGTAACAGATA?CAC 3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB51基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以擬南芥三周大葉片的cDNA為模板經(jīng)RTPCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 059 bp的基因片段如圖1所示，經(jīng)測(cè)序證明與擬南芥的MYB51基因CDS序列一致。以植物表達(dá)載體pCAMBIA230035Su為基礎(chǔ)，經(jīng)PacⅠ和Nt.BbvCIB酶切后，將上述克隆獲得的MYB51基因片段連入載體，構(gòu)建成由組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體（以下稱35S∶MYB51）。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥。經(jīng)篩選獲得具有卡那霉素抗性的植株40株。

圖1 MYB51基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of MYB51

2.2 MYB51轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因整合情況的PCR鑒定

以植物表達(dá)載體序列特異引物和MYB51基因特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，在40株抗性植株中均能擴(kuò)增到長(zhǎng)度約為1 308 bp的預(yù)期片段。35S:MYB51轉(zhuǎn)基因植株的部分PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明MYB51基因已整合至擬南芥的基因組中。

圖2 轉(zhuǎn)MYB51 T1代抗性植株的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR confermation of T135S:MYB51 transgenic plants

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51表達(dá)水平的RT-PCR鑒定

進(jìn)一步通過(guò)半定量RT-PCR方法檢測(cè)T1代PCR陽(yáng)性植株中MYB51是否超表達(dá)。選擇PCR陽(yáng)性植株10株，獲得6個(gè)超表達(dá)株系#L1、#L2、#L3、#L4、#L5和#L6，MYB51在這6個(gè)株系中超量表達(dá)（見圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51的表達(dá)Fig.3 Expression level of MYB51 in transgenic plants

2.3 過(guò)量表達(dá)MYB51基因?qū)胚嶙褰孀佑蛙蘸铣擅富虻挠绊?/h3>

用半定量RT-PCR方法，分析35S:MYB51轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與野生型相比轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)發(fā)生不同程度改變。

如圖4所示，CYP79A2和CYP79B2基因在35S∶MYB51植株中的表達(dá)顯著高于野生型植株。CYP79B3在35S∶MYB51植株中的表達(dá)量稍高于野生型。CYP83B1基因的表達(dá)量與野生型相比變化不太明顯。以上結(jié)果說(shuō)明在過(guò)表達(dá)MYB51基因的植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)水平普遍上升，MYB51轉(zhuǎn)錄因子對(duì)吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。

圖4 35S:MYB51中吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平的變化Fig.4 Expression of indolic glucosinolates biosynthetic genes in 35S:MYB51

2.4 過(guò)量表達(dá)MYB51基因?qū)χ咀褰孀佑蛙蘸铣擅富虻挠绊?/h3>

CYP79F1與CYP79F2基因是脂肪族芥子油苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，半定量RT-PCR分析表明過(guò)表達(dá)MYB51基因的植株中，CYP79F1與CYP79F2基因的表達(dá)量降低（見圖5）。說(shuō)明MYB51轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂肪族芥子油苷合成酶基因CYP79F1與CYP79F2的表達(dá)有一定抑制作用。

圖5 35S:MYB51中脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平的變化Fig.5 Expression of aliphatic glucosinolates biosynthetic genes in 35S:MYB51

2.5 過(guò)量表達(dá)MYB51基因?qū)λ畻钏岷蛙岳蛩嵝盘?hào)途徑標(biāo)記基因的影響

PR1、PR2基因是水楊酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因，PDF1.2為茉莉酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。在過(guò)表達(dá)MYB51基因的植株中，PR1與PR2基因的表達(dá)量降低。PDF1.2基因的表達(dá)量則顯著升高，如圖6所示?？梢哉f(shuō)明MYB51轉(zhuǎn)錄因子抑制PR1與PR2基因的表達(dá)，而強(qiáng)烈誘導(dǎo)PDF1.2基因的表達(dá)。

圖6 35S:MYB51中水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因表達(dá)水平的變化Fig.6 Expression of JA-signal marker genes and SA signal marker gene in 35S:MYB51

3 討論

芥子油苷及其降解產(chǎn)物在植物抗生物脅迫的防御性反應(yīng)中起重要作用[18]。脂肪族和吲哚族芥子油苷是擬南芥中主要的芥子油苷類型，其中吲哚族芥子油苷合成主要由轉(zhuǎn)錄因子MYB51調(diào)控[19-20]。近年大量研究表明，吲哚族芥子油苷的代謝途徑在植物抗病性防御反應(yīng)中必不可少[21-23]，其重要性和作用機(jī)制的復(fù)雜性似乎超出預(yù)測(cè)。吲哚族芥子油苷對(duì)病原菌和昆蟲的防御作用一直被歸結(jié)于化學(xué)毒性，直至發(fā)現(xiàn)吲哚族芥子油苷的水解產(chǎn)物參與細(xì)胞壁胼胝脂合成從而引發(fā)植物廣譜抗菌性。這一新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)使吲哚族芥子油苷的合成、調(diào)控及其抗生物脅迫機(jī)制的研究受到極大關(guān)注[24]。

本研究將MYB51基因轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得PCR檢測(cè)為陽(yáng)性并過(guò)量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中芥子油苷合成途徑相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)MYB51基因?qū)胚嶙褰孀佑蛙蘸铣擅富虻谋磉_(dá)有促進(jìn)作用，而對(duì)脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)有抑制作用，脂肪族芥子油苷的合成與吲哚族芥子油苷的合成之間的關(guān)系有兩種可能：一種是反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)MYB51基因過(guò)量表達(dá)時(shí)，激活吲哚族芥子油苷合成酶基因，使吲哚族芥子油苷大量積累，促使植物體內(nèi)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)，脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)下降，脂肪族芥子油苷的合成減弱。另一種是相互競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。MYB51基因過(guò)量表達(dá)后，激活吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)，消耗大量原料與能量使吲哚族芥子油苷積累，合成脂肪族芥子油苷所需的物質(zhì)能量減少，從而使脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)量降低。可見，脂肪族芥子油苷和吲哚族芥子油苷之間存在競(jìng)爭(zhēng)和相互制約關(guān)系。

MYB51基因的過(guò)量表達(dá)不僅促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，同時(shí)還導(dǎo)致茉莉酸信號(hào)途徑的增強(qiáng)和水楊酸信號(hào)途徑的減弱，說(shuō)明吲哚族芥子油苷或者其降解產(chǎn)物可能是通過(guò)參與逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)。由生物脅迫所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，芥子油苷如何參與這些途徑，以及除細(xì)胞壁胼胝質(zhì)合成外是否引發(fā)其他的防御性反應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

MYB51轉(zhuǎn)錄因子在芥子油苷合成過(guò)程中起重要調(diào)控作用，可促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，同時(shí)抑制脂肪族芥子油苷的合成。MYB51轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的吲哚族芥子油苷合成途徑可直接或間接地增強(qiáng)茉莉酸信號(hào)途徑并抑制水楊酸途徑，并由此啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)。

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