八字地老虎高毒力蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）菌株的篩選

于洪春，王雨薇，宋龍騰，鄧佳佳，許國慶

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽 110161）

八字地老虎（Xestia c-nigrum）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），分布于世界各地，是地老虎的重要種類之一，也是黑龍江省最常發(fā)生的一種地老虎害蟲，其寄主范圍廣泛，對蔬菜、甜菜、煙草、馬鈴薯、豆類、玉米、林木等植物幼苗均可造成危害[1-3]。

目前國內(nèi)對地老虎的防治仍以化學(xué)防治為主，生物防治報(bào)道較少。現(xiàn)有八字地老虎生物防治報(bào)道主要限于八字地老虎核型多角體病毒研究[4-7]，而蘇云金桿菌（Bt）對八字地老虎研究目前還未見報(bào)道。由于蘇云金桿菌是應(yīng)用最廣泛的昆蟲病原微生物之一，且其株系豐富，含有的殺蟲晶體蛋白基因有較大差異，因此殺蟲譜范圍會(huì)存在較大不同。

文章通過50株Bt菌株對八字地老虎幼蟲室內(nèi)的生物測定，以期篩選出對八字地老虎幼蟲有較高毒力的Bt菌株，為研制和開發(fā)防治地老虎的生物制劑提供依據(jù)，為八字地老虎的生物防治開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx與食料

供試?yán)ハx來自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站內(nèi)黑光燈下誘集的八字地老虎成蟲卵孵化出的幼蟲。食料為新鮮白菜（Brassica chinensis L.）葉片。

1.1.2 供試菌株

供試菌株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系害蟲生物防治研究室提供，共50株Bt菌株。

1.1.3 培養(yǎng)基

Bt培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與芽孢計(jì)數(shù)

采用試管斜面接種培養(yǎng)法，在28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，用無菌蒸餾水將蘇云金桿菌制成懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)芽孢數(shù)，每菌株計(jì)數(shù)3次重復(fù)，以求得每小格芽孢數(shù)的平均數(shù)。

各個(gè)菌株芽孢濃度（cfu·mL-1）=每小格內(nèi)芽孢數(shù)平均數(shù)×4×106；

各個(gè)菌株原液芽孢濃度（cfu·mL-1）=每小格內(nèi)芽孢數(shù)平均數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 生物測定

室內(nèi)生物測定方法采用白菜浸漬法[8]，將新鮮白菜葉分別浸泡在50株芽孢濃度均為1×107cfu·mL-1的Bt菌液中，待整個(gè)葉片全部沾有菌液時(shí)取出，陰干之后飼喂4日齡八字地老虎幼蟲，并設(shè)清水為對照。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)20頭幼蟲。幼蟲飼養(yǎng)在25°C，相對濕度70%，光周期L14∶D10的人工氣候箱中。每天更換1次新鮮無毒食料，并記錄死亡蟲數(shù)。在菌液處理72、120和168 h后分別計(jì)算死亡率和校正死亡率。

死亡率（%）=（試蟲總數(shù)-活蟲數(shù)）/試蟲總數(shù)×100；

校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100。

在初篩試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇校正死亡率較高的Bt菌株 5株，分別將其配制成 5×108、1×108、2×107、4×106、8×105cfu·mL-1等5個(gè)不同濃度的菌液，并設(shè)清水為對照，按前述方法對5日齡八字地老虎幼蟲進(jìn)行生物測定，計(jì)算在菌液處理后1、3、5、7、9、10 d幼蟲的死亡率和校正死亡率。以菌液濃度、處理時(shí)間（d）與累計(jì)校正死亡率為參數(shù)，用DPS v7.0.5軟件進(jìn)行生物測定數(shù)據(jù)處理（對數(shù)轉(zhuǎn)換）與分析，獲得八字地老虎幼蟲5、7、10 d的濃度與校正死亡率的毒力回歸方程，求出各菌株LC50值；同時(shí)獲得各菌株在濃度5×108、1×108cfu·mL-1時(shí)的死亡時(shí)間與校正死亡率的回歸方程，求出各菌株的LT50、LT70和LT90。通過參數(shù)比較，篩選出毒力最強(qiáng)的Bt菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 對八字地老虎高毒力Bt菌株初步篩選

50株Bt菌株以濃度為1×107cfu·mL-1的菌液處理4日齡八字地老虎幼蟲，在72、120、168 h的死亡率和校正死亡率見表1。

用DPS v7.05軟件對上述試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)差異顯著性分析，結(jié)果表明，各供試Bt菌株在72 h（df=49，F(xiàn)=12.419，P=0.0001＜0.01）、120 h（df=49，F(xiàn)=11.408，P=0.0001＜0.01）、168 h（df=49，F(xiàn)=5.849，P=0.0001＜0.01）對八字地老虎幼蟲的校正死亡率差異均達(dá)極顯著水平，證實(shí)蘇云金桿菌不同菌株對八字地老虎幼蟲的毒力存在很大差異，其72 h校正死亡率為0～48.3%，120 h校正死亡率為-1.7%～93.2%，168 h校正死亡率為-25%～100%。根據(jù)生物測定結(jié)果，初步篩選出5株對八字地老虎幼蟲具有較高毒力的蘇云金桿菌菌株Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66，其對八字地老虎幼蟲在120 h校正死亡率為52.5%～93.2%，168 h校正死亡率為91.6%～100%。

2.2 對八字地老虎高毒力Bt菌株的進(jìn)一步篩選

將初步篩選出毒力較高的Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66分別等比稀釋成5個(gè)不同濃度，對5日齡八字地老虎幼蟲進(jìn)行室內(nèi)生物測定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 50株Bt菌株對4日齡八字地老虎幼蟲的毒力初步測定Table1 Preliminary determination of virulence of 50 Bt strains to larvae of 4 day-old Xestia c-nigrum

續(xù)表

表2 5株Bt菌株對八字地老虎幼蟲的致死濃度Table2 Median lethal concentration of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

從表2可以看出，初篩獲得的5株Bt菌株在第5天、7天、10天的校正死亡率隨芽孢濃度升高而升高，隨濃度降低而降低。方差分析結(jié)果表明，同一Bt菌株中，高濃度與低濃度對八字地老虎幼蟲校正死亡率達(dá)極顯著差異（P＜0.01）。

以上述5株Bt菌株濃度的對數(shù)和校正死亡率為參數(shù)，用DPS v7.0.5軟件進(jìn)行生物測定數(shù)據(jù)處理（對數(shù)轉(zhuǎn)換）與分析，獲得其對八字地老虎5日齡幼蟲5、7、10 d的毒力回歸方程分別為：菌株Bt15，y=28.61353x-177.58825，r=0.944799； y=37.42650x-226.25199，r=0.983670； y=36.72547x-206.81374，r=0.931267；菌株 Bt43，y=13.83464x-72.68714，r=0.741509； y=31.00276x-180.03209，r=0.946692；y=35.28048x-198.24387，r=0.944261；菌株 Bt47，y=15.25101x-89.66810，r=0.868809；y=22.17549x-125.88389，r=0.805321； y=32.44774x-183.22195，r=0.937154；菌株 Bt65，y=25.03684x-152.49472，r=0.973726； y=30.74524x-182.13192，r=0.921635；y=33.86411x-189.92291，r=0.967302；菌株 Bt66，y=20.50160x-118.34276，r=0.877489；y=24.79362x-141.01900，r=0.857041； y=35.06588x-196.35706，r=0.907212。根據(jù)獲得各菌株的毒力回歸方程，求出各菌株在飼喂菌液后5、7、10 d的LC50值，其結(jié)果見表2。

5株菌株在5×108、1×108cfu·mL-1濃度下校正死亡率與致死時(shí)間的回歸方程和LT50、LT70和LT90值見表3。

表3結(jié)果表明，菌株Bt15對5日齡八字地老虎致死時(shí)間最短，在5×108cfu·mL-1濃度下，其LT50、LT70和LT90分別較其他4株菌株短1.02～3.33、1.81～5.58、3.72～11.85 d；在1×108cfu·mL-1濃度下，分別短0.51～1.71、0.85～4.92、1.75～16.53 d。說明菌株Bt15對八字地老虎幼蟲殺蟲速度優(yōu)于其他Bt菌株。

表3 5株Bt菌株對5日齡八字地老虎的致死時(shí)間Table3 Lethal time of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

綜合表2、表3結(jié)果，通過各Bt菌株LC50和LT50、LT70和LT90的比較，在初篩獲得的毒力較高的5株菌株中，菌株Bt15在第5天、7天、10天的LC50值和LT50、LT70和LT90值均低于其余4株菌株，表明該菌株對八字地老虎幼蟲的生物活性最強(qiáng)，毒力最高。因此，Bt15菌株為篩選到的防治八字地老虎幼蟲的最佳Bt菌株。

3 討論

目前，對八字地老虎的防治以采用擬除蟲菊酯類和有機(jī)磷農(nóng)藥噴霧和土壤處理為主，生物防治研究報(bào)道較少。已有報(bào)道中，分離出的八字地老虎核型多角體病毒對八字地老虎有一定的防治效果[6-7,9]。斯氏線蟲室內(nèi)生物測定對八字地老虎有一定侵染力[10]。一般認(rèn)為，蘇云金桿菌對鱗翅目夜蛾科害蟲防治效果不佳，而地老虎在昆蟲分類上屬于鱗翅目夜蛾科，所以蘇云金桿菌防治地老虎的研究報(bào)道較少。楊建全等測定4株Bt菌株對小地老虎1齡幼蟲的毒力，其毒力最高菌株校正死亡率可達(dá)66.7%，LC50=1.7152×109cfu·mL-1，并發(fā)現(xiàn)幼蟲對Bt處理的葉片有拒食現(xiàn)象，幼蟲增重明顯低于對照[11]。束長龍等篩選并測定了不同Bt菌株對小地老虎的毒力作用，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Cry2Ab殺蟲蛋白的菌液對小地老虎的生長發(fā)育有明顯抑制作用[12]。陸瓊等進(jìn)一步證實(shí)Cry2Ab對小地老虎的殺蟲活性[13]。所以，從大量的不同Bt菌株中有望篩選出對地老虎有較高活性的高毒力菌株。

利用蘇云金桿菌防治八字地老虎是一種可行的生物防治措施，為八字地老虎的生物防治開辟新途徑。本研究建立芽孢濃度與八字地老虎幼蟲死亡率和毒力的關(guān)系，但致昆蟲死亡的另一主要原因是Bt殺蟲晶體蛋白，因此還需深入研究殺蟲晶體蛋白與毒力的相互關(guān)系，以確定所篩選菌株的基因型。

[1]席景會(huì),潘洪玉,陳玉江,等.四種食料植物對八字地老虎生長發(fā)育和繁殖的影響[J].昆蟲知識,2002,39(6):428-429.

[2]蔡志平,張棟海,李克福,等.新疆小海子墾區(qū)果棉間作田黃地老虎、警紋地老虎和八字地老虎成蟲種群動(dòng)態(tài)[J].中國棉花,2012(3):22-24.

[3]鄭英榮,王維升.八字地老虎在北方地區(qū)生物學(xué)特性觀察[J].吉林農(nóng)業(yè),2010,250(12):109.

[4]鄭桂玲,李長友,張履鴻,等.八字地老虎核型多角體病毒的形態(tài)發(fā)生[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,27(1):44-49.

[5]倪巖松,張履鴻,周彥武.八字地老虎核型多角體病毒的研究[J].東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,22(1):20-24.

[6]席景會(huì),潘洪玉,劉偉成,等.八字地老虎核型多角體病毒對宿主昆蟲繁殖潛勢的影響[J].中國病毒學(xué):殺蟲微生物?？?2000,15:76-80.

[7]鄭桂玲,李長友,張履鴻,等.八字地老虎核型多角體病毒的寄主范圍和室內(nèi)增殖以及寄主組織病理的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,29(4):340-344.

[8]慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1994:47-62.

[9]席景會(huì),潘洪玉,劉偉成,等.八字地老虎核型多角體病毒對宿主的弱化作用[J].昆蟲天敵,2000,22(2):75-78.

[10]趙奎軍,宋捷,張麗坤,等.斯氏線蟲對兩種地老虎的侵染效果[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,26(3):242-246.

[11]楊建全,李芳,陳家驊,等.蘇云金桿菌對小地老虎的毒力測定[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,29(1):65-68.

[12]束長龍,谷少華,竇黎明,等.對小地老虎具有殺蟲毒力的蘇云金芽孢桿菌菌株的分離及鑒定[J].植物保護(hù),2007,33(5):41-44.

[13]陸瓊,張永軍,于洪春,等.Cry2Ab殺蟲蛋白對小地老虎幼蟲致死效果及體內(nèi)酶活性的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2009,36(1):16-20.