辣椒堿促進結腸癌轉(zhuǎn)移的實驗研究

朱劍梅，金 科

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)，四川 成都 610101)

結腸癌是目前我國最常見的癌癥之一，癌癥轉(zhuǎn)移是結腸癌治療中一個難點。間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是惡性腫瘤的一個非常重要的起始事件。研究報道炎癥因子與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關［1］。辣椒堿是辣椒中的主要活性成分。近年的研究表明，一定濃度的辣椒堿能引起一系列炎癥因子的高表達，具有抗凋亡和促進血管生成的作用［2］。因此，研究辣椒堿與結腸癌轉(zhuǎn)移的相關機制，具有較高的學術研究和實際應用價值。研究時間:2012年1～10月。研究地點:四川大學生物治療國家重點實驗室。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人結腸癌細胞系SW 480購買于美國標準生物品收藏中心(ATCC)，辣椒堿(純度大于95%)購買于四川金輝公司，癌癥轉(zhuǎn)移的maker蛋白抗體購買于北京中杉金橋，Transwell小室和基質(zhì)膠購買于美國Sigma公司。

1.2 方法 ①用MTT法檢測辣椒堿對sw480細胞增殖的影響:將生長良好的SW480細胞以2×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，將不同濃度辣椒堿(640、320、160、80、40、20 和 10 μM)加入 96 孔板中培養(yǎng)48 h，加入20μl噻唑藍(MTT)(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，在490 nm波長酶標儀檢測OD值。②細胞劃痕實驗檢測細胞遷移［3］:將生長良好的SW480細胞以6×104個/孔接種于六孔板中培養(yǎng)24 h，待密度達到90%時，用200μl的槍頭輕輕在六孔板中劃過，用1 m l雙無培養(yǎng)基清洗三次，加入辣椒堿和DMSO分別處理48 h。放入孵箱培養(yǎng)48 h。48 h后倒置顯微鏡觀察并照相。③Transwell、基質(zhì)膠實驗檢測辣椒堿對細胞轉(zhuǎn)移的影響:細胞侵襲和浸潤實驗在Transwell小室中進行［4］。于10倍顯微鏡下觀察并照相，將膜上下左右5個視野計算穿過的細胞數(shù)，求其平均值。④WB檢測相關蛋白表達:將經(jīng)過辣椒堿處理的SW480細胞裂解液用SDS-PAGE分離，根據(jù)蛋白質(zhì)免疫印記(Western blotting，WB)方法［5］將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，然后用 25 m l TBST(Tris，2.422 g;Nacl，8.775 g;Tween20，1 ml，蒸餾水至 1000 ml;pH 7.4)洗膜 5 min。置膜于25 ml封閉緩沖液(含0.1%TweenTBST溶液配制的5%脫脂牛奶中1 h，室溫，搖動。15 ml TBST洗3次(5 min每次)。加入1︰200稀釋的相應的一抗，37℃ 孵育2 h，緩慢搖動。15 ml TBS/T洗3次(5 min每次)。加入相應的二抗室溫孵育1 h，搖動。然后用15 ml TBS/T洗3次(5 min每次)。15 mL TBS洗1次。加入WB顯影液，放于化學發(fā)光儀的暗室中曝光，照相并數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 辣椒堿對結腸癌細胞和浸潤能力的影響MTT法檢測結果顯示SW 480細胞在40～80μM濃度的辣椒堿作用下出現(xiàn)增殖現(xiàn)象(圖1)。劃痕實驗結果顯示細胞向劃痕處生長并靠攏(圖2)，Transwell、基質(zhì)膠實驗結果顯示辣椒堿處理的SW 480比未經(jīng)藥物處理明顯增多(圖3、圖4)。

圖1 不同濃度的辣椒堿作用于SW 480細胞48 h的抑制率

圖2 劃痕實驗檢測80μM的辣椒堿促進SW480轉(zhuǎn)移

圖3 Transwell檢測辣椒堿對SW480遷移的影響

2.2 辣椒堿對結腸癌細胞轉(zhuǎn)移基因表達的影響80μM辣椒堿處理48 h后，SW480細胞中的E-cadherin明顯減少，并增強了N-cadherin和Vimentin的表達，也增強了信號分子β-catenin的表達，MMP-9、MMP-2及VEGF的表達也明顯增強(圖5)。

圖4 基質(zhì)膠檢測辣椒對SW480浸潤的影響

圖5 癌癥轉(zhuǎn)移過程標志蛋白的免疫印記，辣椒堿促進惡性基因表達

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學特征之一。近年來的研究表明，EMT是癌癥轉(zhuǎn)移過程中最重要的啟示事件。EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得侵襲能力及發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要生物學過程，是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移啟動中最重要的機制。它表示表皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程。這個過程的改變加強了細胞的遷移和侵襲能力。N-cadherin、E-cadherin、β-catenin是EMT發(fā)生的重要標志。本研究發(fā)現(xiàn)辣椒堿能促進腫瘤細胞遷移和侵襲能力，主要是通過增強細胞EMT產(chǎn)生的，但具體機制還需要進一步研究。

上皮癌細胞中，遷移和浸潤能力增強往往伴隨著形態(tài)的改變［6］，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。在癌癥轉(zhuǎn)移過程中惡性基因MMP-9和MMP-2的表達有助于細胞間基質(zhì)的降解［7］。同時VEGF基因與結腸癌腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長密切相關［8］。已有報道稱辣椒堿抑制VEGF所介導的血管生成［9］。Kalluri等報道稱辣椒堿激活一系列惡性基因(如MMP-2)的表達而提高細胞的轉(zhuǎn)移能力［10］，如乳腺癌;Sara等研究報道稱辣椒堿能夠促進乳腺癌細胞向肺和心臟轉(zhuǎn)移［11］。以上這些研究表明辣椒堿的生理功能是受到很多因素的影響，包括濃度、組份、細胞類型等。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度辣椒堿促進SW480的轉(zhuǎn)移，證明辣椒堿具有多種生物功能，這與辣椒堿的濃度可能存在相關性。

本研究結果表明辣椒堿促進了結腸癌的轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)EMT途徑中關鍵蛋白的表達。但需要進步研究辣椒堿對不同細胞系的影響和機制，探索辣椒堿的生物學功能。

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