乙二醇/絲素蛋白共混膜的研究

錢(qián)巧芬，張珊珊，侯 靜，吳 琪，盧神州

(1.蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇蘇州215123;2.南通蘇州大學(xué)紡織研究院，江蘇蘇州215123)

幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，蠶絲作為一種紡織材料，因其特殊的光澤和良好的機(jī)械性能而廣為人知［1］。蠶絲能被溴化鋰、硫氰酸鋰、硫氰酸鈣、氯化鈣等的濃溶液溶解［2］，從而加工成其他形態(tài)的材料，如直徑為微米級(jí)和納米級(jí)的絲素纖維、絲素膜、絲素水凝膠、多孔材料、球狀骨針、膠囊等［3］。一般認(rèn)為，絲素蛋白除了無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，還存在SilkⅠ和SilkⅡ兩種結(jié)晶結(jié)構(gòu)。研究表明，濕熱法、有機(jī)溶劑法和拉伸處理法能夠促使絲素蛋白從無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變［4］，最終使得絲素蛋白材料不溶于水。得益于其良好的生物相容性，很多種類(lèi)的細(xì)胞能在絲素膜上生長(zhǎng)［5］。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以在絲素膜上生長(zhǎng)，表明絲素膜可以用于角膜移植［6］。人角膜成纖維細(xì)胞在絲素膜及絲素多孔材料上培養(yǎng)結(jié)果表明，絲素蛋白材料對(duì)角膜組織的修復(fù)有重大的利用價(jià)值［7］。但是絲素溶液直接澆鑄在基質(zhì)上，待液體揮發(fā)并最終轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?，得到的絲素膜脆性較大，強(qiáng)度不夠，且易溶于水［8］，使其應(yīng)用于角膜的修復(fù)受到限制。因此，如何改善絲素蛋白膜的水溶性及透明性，使其更加符合人角膜移植的要求是目前角膜組織修復(fù)的一個(gè)熱點(diǎn)。目前有些文獻(xiàn)采用絲素蛋白與其他化合物或天然高聚物共混合來(lái)改善其水溶性及生物相容性［9］。絲素蛋白溶液與山梨醇或肌醇共混，可以制備出不溶于水的透明絲素膜［10］，但是兩種共混膜只能在干態(tài)下保持較好的透光率，在濕態(tài)時(shí)透光率不理想，使其在角膜修復(fù)工程上的應(yīng)用受到了限制。因此，需要尋求一種醇類(lèi)化合物，在將其與絲素蛋白混合后，共混膜在干、濕態(tài)都能保持良好的透光率。

將一定比例的聚乙二醇混入絲素膜可使膜在保持原有良好生物性質(zhì)前提下改善膜的柔韌性，且透光性較好，但因其聚合物相對(duì)分子量較大，故與絲素的可混性稍差［11］。因此，本文考慮采用相對(duì)分子量較小的乙二醇，與絲素共混的方法制得絲素蛋白透明共混膜，對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了研究，并在其上培養(yǎng)L929細(xì)胞，研究其生物相容性。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 絲素蛋白共混膜的制備

家蠶生絲置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的Na2CO3溶液中，于98～100℃處理30 min，重復(fù)3次，脫去生絲中的絲膠。洗凈干燥后的純絲素纖維在65℃下溶解于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，透析3 d后過(guò)濾得到純絲素溶液。

取40 mL絲素溶液，按乙二醇/絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0︰10、1︰10、2︰10、3︰10、4︰10、5︰10、6︰10 的比例向絲素溶液中加入相應(yīng)質(zhì)量的乙二醇，混合均勻后倒入聚苯乙烯塑料模具中，在室溫下于通風(fēng)櫥中風(fēng)干即得共混膜。

1.2 結(jié)構(gòu)表征

使用全自動(dòng)X'PERT PRO MPD射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)，CuKα射線，在管電壓40 kV﹑管電流35 mA﹑掃描速度10°/min的條件下，記錄得到2θ=5°～45°的衍射強(qiáng)度曲線。用Nicolet 5700 FI-IR型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)試，將共混膜加工成直徑小于80 μm的粉末后，KBr壓片制樣，測(cè)試4 000～400 cm-1吸光度得到共混膜的紅外吸收光譜。

1.3 溶失率測(cè)定

將共混膜在恒溫恒濕(25℃，相對(duì)濕度65%)下平衡24 h，每個(gè)稱(chēng)取質(zhì)量W1(g)的樣品3塊，然后在烘箱中105℃烘至恒重。稱(chēng)重得到W2(g)。含水率C的計(jì)算公式:

將共混膜在恒溫恒濕(25℃，相對(duì)濕度65%)環(huán)境中平衡24 h，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g左右的樣品W1，放入錐形瓶中，按浴比1︰100加入去離子水，37℃水浴預(yù)熱30 min后在37℃的水浴恒溫震蕩器中震蕩24 h，然后取出溶液。用Smartspec型紫外分光光度計(jì)測(cè)出溶液在278 nm下的吸光度A。共混膜的絲素蛋白溶失率D計(jì)算公式:

式中:K為絲素溶液的紫外吸光常數(shù)，K=1.102 6。

剩下的絲素膜固體用去離子水沖洗3遍后放入105℃烘箱中烘干得W2。共混膜的質(zhì)量溶失率Z計(jì)算公式:

1.4 力學(xué)性能測(cè)試

使用美國(guó)Instron3365型萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測(cè)試，拉伸速度為20 mm/min，夾距為28 mm，試樣是按照GB/T1040—2006標(biāo)準(zhǔn)工字3型刀具壓出的樣條。測(cè)試干態(tài)強(qiáng)力前將樣條在恒溫恒濕(25℃，相對(duì)濕度65%)中平衡24 h;濕態(tài)強(qiáng)力測(cè)試則是將樣品于生理鹽水中浸泡24 h后，取出擦干測(cè)定。

1.5 透光率測(cè)定

將共混膜平鋪置于24孔板板底，用酶標(biāo)儀(BIO-TEK SYNERGY)分別測(cè)定 492、550 nm及700 nm處的吸光度值(A)。干態(tài)透光率直接鋪板測(cè)定。測(cè)試濕態(tài)下的透光率時(shí)，先將膜在去離子水中浸泡24 h，再將其平鋪于培養(yǎng)板底，加入1 mL去離子水進(jìn)行測(cè)試。不同波長(zhǎng)下各檢測(cè)4個(gè)孔，取平均值。透光率T計(jì)算公式:

1.6 降解性

選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙二醇共混膜分別用tris緩沖溶液和蛋白酶-ⅩⅣ溶液降解，對(duì)照樣為用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡2 h的純絲素膜。將兩種材料于去離子水中浸泡72 h后取出，干燥后稱(chēng)取降解樣品0.1 g置入離心管中，按浴比1︰100分別向其中加入10 mL的tris緩沖溶液，2 U/mL的蛋白酶ⅩⅣ溶液，放置于37℃的水浴恒溫震蕩器中降解，每?jī)商鞊Q液一次。分別于第1、3、6、9、12、15 d 取出樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，用去離子水充分洗滌后干燥并稱(chēng)重，計(jì)算出失重率，將第3 d的樣品制成粉末用于X射線衍射。

1.7 細(xì)胞相容性

將含乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的絲素溶液直接加入24孔板風(fēng)干成膜，對(duì)照樣為經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇處理過(guò)的純絲素膜。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，兩種材料各重復(fù)4孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于接種后1、3、5 h計(jì)數(shù)未黏附的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的黏附率。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，兩種材料各重復(fù)6孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。分別于 1、3、5、7、9 d，每孔加入20 μL摩爾濃度為50 μmol/L的樹(shù)脂天青溶液，并于培養(yǎng)箱中孵育6 h;在酶標(biāo)儀上測(cè)定其熒光強(qiáng)度(FLU 值，激發(fā)波長(zhǎng)530 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 590 nm)［12］，測(cè)定細(xì)胞增殖率。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲素蛋白膜的結(jié)構(gòu)

乙二醇/絲素共混膜的X衍射曲線和紅外光譜圖分別如圖1(a)和圖1(b)所示。由圖1(a)中可以看出純絲素膜主要以無(wú)定形結(jié)構(gòu)為主，曲線b～g均在 12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°處有衍射峰出現(xiàn)，這說(shuō)明乙二醇主要是誘導(dǎo)絲素蛋白由無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)向Silk I結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變;另外當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為 5/10、6/10(圖中的 f，g)時(shí)，2θ在 9.1°出現(xiàn)了Silk II的衍射峰，說(shuō)明隨著乙二醇濃度的升高，逐漸形成Silk II型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

圖1 絲素蛋白共混膜的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of blend silk fibroin membranes

由圖1(b)可以看出，純絲素膜的紅外吸收峰在1 651.5 cm-1(酰 胺 I)，1 542 cm-1(酰 胺 II)，1 244 cm-1(酰胺 III)，屬于無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)［13］。乙二醇/絲素質(zhì)量比為1/10、2/10、3/10(圖中的 b，c，d)時(shí)，共混膜中的絲素蛋白在酰胺I、酰胺II、酰胺III區(qū)的吸收峰均在1 653.8、1 541.9、1 242 cm-1附近，與純絲素膜的吸收峰位置相近，由于在紅外譜圖上難以區(qū)分α螺旋與無(wú)規(guī)卷曲，結(jié)合前面的X射線衍射結(jié)果，可以得出這3種比例的乙二醇/絲素共混膜中的絲素蛋白均為α螺旋構(gòu)象。當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為4/10、5/10(圖中的 e，f)時(shí)，共混膜在酰胺 I、酰胺 II區(qū)的吸收峰變寬;繼續(xù)增加乙二醇的濃度，共混膜逐漸在1 629 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，1 653.8 cm-1處的吸收峰也逐漸變?nèi)?，這說(shuō)明，當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比超過(guò)4/10時(shí)，共混膜中的α螺旋構(gòu)象逐漸減少，β折疊構(gòu)象逐漸增多。

由此可知，當(dāng)乙二醇濃度較低時(shí)，其主要促進(jìn)絲素蛋白由無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)向Silk I結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而當(dāng)乙二醇/絲素為6/10時(shí)，有部分絲素蛋白向Silk II結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

3.2 溶失率

乙二醇/絲素共混膜的熱水溶失率如圖2所示。在圖2(a)中可以看出，乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，共混膜的絲素蛋白溶失率就從純絲素膜的90%降至5%以下，繼續(xù)增加乙二醇的含量，絲素蛋白的溶失率幾乎不變。因此可知，當(dāng)加入的乙二醇的質(zhì)量占絲素蛋白質(zhì)量的10%時(shí)，絲素膜就開(kāi)始不溶，故可以通過(guò)將乙二醇與絲素蛋白共混解決絲素蛋白的水溶性問(wèn)題。

在圖2(b)中，乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，共混膜中的乙二醇幾乎全部溶出，隨著乙二醇濃度的升高，共混膜的質(zhì)量損失率呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為6/10時(shí)，質(zhì)量損失率約為20%，故可知共混膜中的乙二醇還有部分未溶出。

圖2 絲素蛋白膜的溶失率Fig.2 Dissolve-loss rate of silk fibroin membranes

3.3 力學(xué)性能

乙二醇/絲素共混膜在干態(tài)和濕態(tài)下的力學(xué)性能如圖3所示。在干態(tài)下，共混膜的強(qiáng)度隨著乙二醇含量的增加而下降，應(yīng)變則隨著乙二醇含量的增加先增大后減小，這說(shuō)明乙二醇對(duì)絲素蛋白起到增塑作用。同時(shí)可以看出，當(dāng)乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，共混膜柔韌性最好，所以可以通過(guò)調(diào)控乙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)制備出所需的力學(xué)性能的絲素蛋白膜。

圖3 絲素蛋白膜的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin membranes

從圖3(b)中可以看出，在濕態(tài)下，共混膜的強(qiáng)度隨著乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而下降，伸長(zhǎng)率變化的規(guī)律也是如此。

3.4 透光性

人眼角膜的透光率隨著波長(zhǎng)的增加而上升，在450 nm處約為80%，在500 nm處接近90%，700 nm以上時(shí)透光率趨于穩(wěn)定約為95%［14］。干、濕態(tài)下的共混膜在450、500、700 nm波長(zhǎng)下的透光率如圖4所示。由圖4(a)可以看出，在干態(tài)下，共混膜的透光率極好，均在90%以上，且乙二醇含量的增加對(duì)干態(tài)透光率影響不大。由圖4(b)可以看出，與干態(tài)相比，共混膜濕態(tài)透光率略有下降，但仍有著較高的透光率，且其透光率均在90%以上。由此可見(jiàn)，乙二醇絲素蛋白共混膜透光率接近人的角膜，可望用于人的眼角膜修復(fù)材料。

圖4 透明絲素蛋白膜的透光性Fig.4 Light transmission of transparent silk fibroin membranes

3.6 體外降解

乙二醇/絲素共混膜在蛋白酶XIV溶液中的降解情況如圖5所示。純絲素膜和乙二醇/絲素共混膜在tris緩沖溶液中幾乎不降解。從圖5(c)可以看出，純絲素膜在蛋白酶溶液中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈線性下降，在第15 d的時(shí)候，質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至50%左右。共混絲素膜則在降解第1 d的時(shí)候，質(zhì)量分?jǐn)?shù)就下降至35%左右，在第3 d時(shí)，下降至13%左右，最后在第6 d時(shí)幾乎全部降解，質(zhì)量分?jǐn)?shù)還剩6%左右，之后質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯?？梢?jiàn)蛋白酶XIV對(duì)Silk I結(jié)構(gòu)的絲素膜降解作用較強(qiáng)。

圖5 絲素膜在降解過(guò)程中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.5 Weight changes of silk fibroin membranes during enzymatic degradation

3.7 細(xì)胞相容性

L929細(xì)胞在兩種絲素膜上的黏附率如圖6所示。從圖6可以得知，細(xì)胞在共混絲素膜上的黏附率較好，在1 h后就達(dá)到了80%以上，并隨著時(shí)間的增加繼續(xù)增加。通過(guò)SPSS軟件分析，乙二醇共混膜與純絲素膜的細(xì)胞黏附率無(wú)顯著性差異，但要優(yōu)于純絲素膜。

圖6 L929細(xì)胞在透明絲素膜上的黏附率Fig.6 Cell attachment of L929 cells on transparent silk fibroin membranes

圖7 L929細(xì)胞在不同材料上培養(yǎng)不同天數(shù)的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.7 Phase contrast light microscope images of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，如圖7所示。從圖7可以看出，第1 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)目較少，不同材料間沒(méi)有明顯差異;第3 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，說(shuō)明兩種材料增殖均較好，純絲素膜和共混膜上的細(xì)胞形態(tài)較好，細(xì)胞呈梭形、三角形以及多邊形，分散也較均勻;培養(yǎng)第5 d時(shí)，兩種材料上的細(xì)胞均鋪滿(mǎn)整個(gè)視野，并開(kāi)始有圓縮細(xì)胞產(chǎn)生，細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯差異?？傮w看來(lái)，共混膜上的細(xì)胞不僅形態(tài)良好，且能夠很好地分散在膜上各處，說(shuō)明共混膜能夠很好地支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。

FLU值的大小反應(yīng)了活細(xì)胞的數(shù)量，如圖8所示。從圖8可以看出，L929細(xì)胞在共混膜上的增殖較好，在第5d和第7d時(shí)，略好于純絲素膜。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，兩者沒(méi)有顯著性差異。

圖8 L929細(xì)胞在不同材料上培養(yǎng)不同天數(shù)的FLU值Fig.8 Fluorescence value of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

由上可知，共混膜在黏附率和細(xì)胞增殖上與純絲素膜均沒(méi)有顯著性差異，但又略?xún)?yōu)于純絲素膜。另外，共混膜在乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)即不溶于水，且柔軟性明顯優(yōu)于純絲素膜，在生物材料上的應(yīng)用更加廣泛。

4 結(jié)論

1)乙二醇/絲素共混膜的絲素溶失率小于2%，具有較高的強(qiáng)度與較好的斷裂伸長(zhǎng)率，在干濕態(tài)下的透光率都超過(guò)90%，滿(mǎn)足角膜修復(fù)材料的要求。

2)乙二醇/絲素共混膜的主要結(jié)晶結(jié)構(gòu)為SilkI，在tris緩沖溶液中幾乎不降解，在蛋白酶中降解性較好。

3)乙二醇/絲素共混膜，能夠很好地支持成纖維細(xì)胞在其上的黏附與增殖，細(xì)胞相容性良好。

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