微囊藻毒素-LR的分離純化

張淑華，王晴，陳玉娟，葛淑敏

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

隨著水體環(huán)境污染的加劇，水中有害藍(lán)藻水華事件頻繁發(fā)生，已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題。微囊藻毒素為有害藍(lán)藻釋放的一類(lèi)具有強(qiáng)烈促癌作用的肝毒素［1］。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是微囊藻毒素中毒性最強(qiáng)的一種。大量研究表明，動(dòng)物肝臟是MC-LR作用的重要靶器官，可導(dǎo)致肝臟損傷繼而發(fā)展成肝癌。最近研究表明，除肝臟外，MC-LR也可引起生物急性腎損傷，免疫系統(tǒng)紊亂，甚至影響生物的生殖系統(tǒng)，具有遺傳毒性［2-4］。這給人體健康帶來(lái)了巨大的威脅與隱患。世界衛(wèi)生組織規(guī)定飲用水中 MC-LR 的限定值為 1μg/L［5］，并于1998年正式納入飲用水標(biāo)準(zhǔn)中。我國(guó)2007年出臺(tái)的新版《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)》也已將微囊藻毒素列入了水質(zhì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)中。

目前，MC-LR的結(jié)構(gòu)性質(zhì)已明了。國(guó)內(nèi)外對(duì)其毒性作用機(jī)制、檢測(cè)方法、治理手段、疾病治療等方面正展開(kāi)積極的研究。本文利用萃取、高效液相層析法等從銅綠微囊藻中分離純化MC-LR，為MC-LR的上述相關(guān)研究提供純品。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

銅綠微囊藻FACHB905購(gòu)自中國(guó)水生生物研究所。

1.2 主要試劑與器材

MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自瑞士Alexis公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸鈉、硼酸、氯化錳、硫酸鋅、硫酸銅、鉬酸鈉、硝酸鈷、甲醇、乙酸乙酯、乙酸等均購(gòu)自北京化工廠(chǎng)，上述均為分析純。

高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50A）、高速低溫離心機(jī)（Scanspeed1736R）、超凈工作臺(tái)（BJ-2CD）、超聲波細(xì)胞破碎儀（JY650）、高效液相色譜儀（Agi-lent1200）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）、冷凍干燥機(jī)（ALPHA2-4）等均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)與藻細(xì)胞收集

（1）在無(wú)菌的條件下，將由中國(guó)水生生物研究所購(gòu)買(mǎi)的FACHB905藻液平均分為兩部分，分別接入裝有30mL已滅菌的BG-11的錐形瓶中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)記下初始藻細(xì)胞濃度。

（2）在室溫條件下采用自然光照靜置培養(yǎng)，每天定期搖動(dòng)8～10次，每隔一天用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)以掌握銅綠微囊藻的生長(zhǎng)情況。

（3）通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞數(shù)繪制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

（4）當(dāng)銅綠微囊藻培養(yǎng)至藻細(xì)胞數(shù)最大時(shí)開(kāi)始收集，將藻液于25℃下，10000rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀。

1.3.2 溶液萃取

（1）收集到的藻細(xì)胞沉淀按體積比1∶3加蒸餾水重懸，重懸后用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎，超聲波破碎條件為400W，工作3s，停頓4s，超聲100次。

（2）超聲后藻液分成兩份，分別加入等體積乙酸乙酯溶液和1.5倍體積的甲醇溶液，再次超聲，條件如（1）中所述。

（3）再次超聲后，25℃，10000rpm離心7min，添加乙酸乙酯溶液的離心管中物質(zhì)分三層，取最下層水相溶液，而添加甲醇溶液的離心管中物質(zhì)分兩層，取上清溶液，分別用漏斗過(guò)濾，濾液分別存放于4℃過(guò)夜。

（4）濾液重新離心，條件如（3）中所述，留取上清液，用0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液于4℃保存。

1.3.3 MC-LR純化

（1）添加乙酸乙酯溶液萃取得到的最終濾液等體積加入甲醇溶液去除雜蛋白，25℃，10000rpm離心10min，取上清液，用0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液即為MC-LR粗品。而直接添加甲醇溶液萃取得到的最終濾液無(wú)需經(jīng)過(guò)此過(guò)程。用HPLC分別分析檢測(cè)兩種萃取方法獲得的MC-LR粗品，對(duì)比兩種溶液萃取方法的優(yōu)劣。

（2）MC-LR粗品經(jīng)HPLC純化，色譜條件為：

柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動(dòng)相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。

（3）收集目的餾分并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除甲醇，然后進(jìn)行冷凍干燥得到MC-LR純品。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

圖1 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)

將由中國(guó)水生生物研究所購(gòu)得的銅綠微囊藻轉(zhuǎn)接后在室溫（25℃）條件下自然光光照靜置培養(yǎng)，每天定期搖動(dòng)8～10次，并且每天進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)記錄細(xì)胞數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)繪制藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示。研究表明，處于生長(zhǎng)期的藍(lán)藻細(xì)胞能主動(dòng)釋放約40%的毒素，而大部分（60%～80%）的毒素都是在藻細(xì)胞衰老和死亡時(shí)才釋放［6］，因此確定藻細(xì)胞的生長(zhǎng)周期對(duì)掌握收集藻細(xì)胞提取MC-LR的時(shí)期十分重要。由圖1可以看出，銅綠微囊藻開(kāi)始培養(yǎng)后在第5d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)到第8d時(shí)細(xì)胞數(shù)最大，進(jìn)入穩(wěn)定期（穩(wěn)定期是代謝產(chǎn)物尤其是次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的主要時(shí)期）。第9d左右開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)下降趨勢(shì)。根據(jù)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)最快的原理，試驗(yàn)中取培養(yǎng)6d的藻液轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（比例為1∶8），由于細(xì)胞進(jìn)入衰亡期后期會(huì)出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，為后續(xù)分離帶來(lái)很大的麻煩，所以綜合考慮后確定，藻細(xì)胞大量收集的最佳時(shí)間為培養(yǎng)后第8-9d，收集足夠多的藻細(xì)胞后進(jìn)行MC-LR提取。

2.2 MC-LR的提取

將收集的藻細(xì)胞用超聲波破碎儀破碎。超聲波破碎時(shí)的時(shí)間和功率及破碎過(guò)程中產(chǎn)生的熱量對(duì)MC-LR的提取效率及生物活性均有影響，經(jīng)試驗(yàn)分析采用400W，工作3s，停頓4s，超聲100次的操作方式綜合效果最好。

收集破碎藻液，分別采用乙酸乙酯-甲醇和甲醇作為萃取劑進(jìn)行萃取，將兩種萃取方法獲得的MC-LR粗提液的HPLC色譜圖與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，由乙酸乙酯萃取除去雜質(zhì)再用甲醇除雜蛋白的效果比直接用甲醇溶液進(jìn)行萃取的效果好，雜質(zhì)較少。這可能是因?yàn)榧状紭O性較大，萃取后溶液中含有可溶于甲醇的極性強(qiáng)和極性弱的雜質(zhì)，而先加極性較弱的乙酸乙酯可去除極性較弱的雜質(zhì)。因此，選用乙酸乙酯-甲醇這種萃取方法獲得的MC-LR粗提液進(jìn)行進(jìn)一步純化效果較好。

2.3 MC-LR的純化

經(jīng)乙酸乙酯-甲醇萃取后得到的粗提液采用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步純化，經(jīng)條件摸索得到純化條件為柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動(dòng)相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。經(jīng)與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜（圖2）相比，上述條件下MC-LR純化效果（圖3）較理想。收集目的餾分，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，再經(jīng)冷凍干燥獲得純品固體粉末，純度可達(dá)94%。

圖2 MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖3 MC-LR純品高效液相色譜圖

3 結(jié)論

通過(guò)培養(yǎng)銅綠微囊藻和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，觀(guān)察銅綠微囊藻的生長(zhǎng)周期，確定其第5d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6d進(jìn)行移種擴(kuò)大培養(yǎng)，接種比例為1∶8，第8d藻細(xì)胞數(shù)量最大，藻細(xì)胞大量收集的最佳時(shí)期為銅綠微囊藻培養(yǎng)后的第8-9d，之后用于MC-LR的提取。

將收集到的藻細(xì)胞采用超聲波細(xì)胞破碎儀在400W，工作3s，停頓4s，超聲100次的條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后對(duì)乙酸乙酯-甲醇和甲醇兩種溶劑萃取方法的萃取效果進(jìn)行比較，得出先用乙酸乙酯萃取細(xì)胞破碎液中極性較弱的雜質(zhì)，再用甲醇除雜蛋白的除雜效果較好。對(duì)經(jīng)乙酸乙酯-甲醇溶劑萃取得到的MC-LR粗提液進(jìn)行過(guò)濾，并采用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化，純化條件為柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動(dòng)相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40：60）。最終經(jīng)冷凍干燥獲得MC-LR純品，經(jīng)分析純度可達(dá)94%。

本文分離純化得到的MC-LR可用于MC-LR毒性作用機(jī)制、MC-LR所致水體污染檢測(cè)及水體污染治理等相關(guān)方面的研究，為水體環(huán)境的檢測(cè)、保護(hù)及人體健康等方面提供有效服務(wù)。

［1］Dawson R M.The toxicology of microcystins［J］.Toxicon，1998，36（7）：953-962.

［2］Liu Y D，Song L R，Li X Y.The toxic effects of microcystin-LR on embryo-larval and juvenile development of loach，Misgurunsm izolepis Gunthe.［J］.Toxicol，2002，40（4）：395-399.

［3］CHEN J，XIE P.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcystins-LR and-RR in two freshwater shrimps，palaemon modestus and macrobrach iumnipponensis，from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Toxicon，2005，45（5）：615-625.

［4］CHEN J，XIE P，GUO L，et al.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcys-tins-LR and-RR in a freshwater snail（Bellamya aerugino sa） from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Environ Pollut，2005，134（3）：423-430.

［5］World Health Organization.Guidelines for Drinking Water Quality［R］.Switzerland：Health Organization，Geneva，1998.