同一離體培養(yǎng)下梓樹屬不同種的反應(yīng)差異1)

于永明

(甘肅省小隴山林業(yè)科學(xué)研究所，天水，741022)

王軍輝 麻文俊

(國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所))

馬建偉 張宋智 韓云花 李平英

(甘肅省小隴山林業(yè)科學(xué)研究所)

灰楸(Catalpa fargesii Bureau)、滇楸(Catalpa fargesii f.duclouxii Dode)、梓樹(Catalpa ovata G.Don)、黃金樹(Catalpa speciosa(Barney)Engelm)、楸樹(Catalpa bungei C.A.Meyer)為紫葳科梓樹屬(Catalpa scop)較有代表的5個(gè)種，目前，國內(nèi)外對楸樹各方面已展開研究，并取得一定成果，關(guān)于梓樹屬方面做組培研究的文獻(xiàn)還未見報(bào)道，尤其是屬內(nèi)不同種間的對比性試驗(yàn)[1－7]?！笆晃濉逼陂g，珍貴闊葉樹種種質(zhì)創(chuàng)新課題組對梓樹屬不同種源和無性系選擇、目標(biāo)樹選擇和培育、立地選擇、干形培育、混交林結(jié)構(gòu)調(diào)整、密度控制和水肥調(diào)控等關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了深入研究，建立珍貴用材林定向單株培育的科技創(chuàng)新平臺，提高了我國珍貴用材林培育的技術(shù)創(chuàng)新能力。在梓樹屬組培研究領(lǐng)域，國內(nèi)對楸樹研究報(bào)道較多，各研究配方與針對種源有所不同，普遍應(yīng)用楸樹嫩枝為外植體，有部分研究人員對楸樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行研究并取得一定的研究結(jié)論[8－9]。珍貴闊葉樹種種質(zhì)創(chuàng)新課題組對梓樹屬組培技術(shù)進(jìn)行了深入研究，已成功對優(yōu)良無性系大批量生產(chǎn)，為規(guī)范優(yōu)良無性系組培技術(shù)并便于生產(chǎn)，制定了《楸樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程》地方標(biāo)準(zhǔn)[10]，為良種的推廣應(yīng)用及開發(fā)提供了重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。為進(jìn)一步選育特性良種，應(yīng)用梓樹屬遺傳轉(zhuǎn)化體系，有必要對其組織培養(yǎng)特性進(jìn)行研究。本試驗(yàn)對典型的5個(gè)種進(jìn)行組織培養(yǎng)比較研究，以探討梓樹屬不同種再生芽增殖和生根培養(yǎng)遺傳因素及外界條件影響的大小，通過不同種間離體植株再生能力及性狀表型間的差異，揭示其誘導(dǎo)表現(xiàn)規(guī)律和特點(diǎn)，為建立不同種快繁及遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料為珍貴闊葉樹種種質(zhì)創(chuàng)新課題組收集的5個(gè)種:灰楸(河南洛陽)、滇楸(貴州畢節(jié))、黃金樹(遼寧恒仁)、梓樹(遼寧開原)、楸樹(河南洛陽)，在中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所培育這些種的組培苗。

1.1 增殖與生根培養(yǎng)

選擇生長狀況一致的無菌組培苗，轉(zhuǎn)接增殖分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上。每個(gè)種接種10瓶，每瓶接種3個(gè)分生株，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。增殖培養(yǎng)莖段為帶1個(gè)腋芽的莖段，確保誘導(dǎo)分化在同一水平;生根莖段長度為1.5 cm，確保插入培養(yǎng)基莖段部位沒有腋芽，以免影響根系的誘導(dǎo)。

繼代增殖分化培養(yǎng)基為 DKW+1.0 mg·L－16－BA+0.2 mg·L－1IBA+25 g·L－1蔗糖+4.5 g·L－1瓊脂(pH值5.8);生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+0.1 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－1NAA+10 g·L－1蔗糖+5.0 g·L－1瓊脂(pH值5.8)。組培苗培養(yǎng)溫度為22～26℃，光照強(qiáng)度為2000 lx，光照時(shí)間為14 h·d－1。

1.2 移栽煉苗

基質(zhì)配比為V(泥炭土)∶V(珍珠巖)=4∶1，基質(zhì)應(yīng)于煉苗前提前配好并裝入營養(yǎng)缽，營養(yǎng)缽一般采用規(guī)格為8 cm×8 cm，配基質(zhì)時(shí)適量加入多菌靈。煉苗時(shí)將生根瓶苗置于溫室，適應(yīng)環(huán)境7 d左右松開封瓶繩，隔天將瓶膜松開，10 d左右移栽，移栽后及時(shí)覆膜，遮陰，每天噴水3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

增殖培養(yǎng)10、25、35 d觀測統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)指標(biāo):增殖芽數(shù)、芽長、葉數(shù)、接入莖段基部愈傷組織橫向及縱向膨大情況。生根培養(yǎng)30 d后觀測統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)指標(biāo):接入莖段發(fā)根數(shù)、根長、發(fā)芽數(shù)、芽長、葉數(shù)。依據(jù)芽數(shù)與芽長計(jì)算增殖系數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS14.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 梓樹屬不同種不定芽增殖差異

芽的繼代增殖，種的不同增殖效果有著明顯差異，這說明不同種在芽增殖生長上對培養(yǎng)基具有選擇性。方差分析表明，增殖分化指標(biāo)增殖系數(shù)(P=0.055)、增殖芽數(shù)(P=0.0005)、芽長(P=0)、葉數(shù)(P=0)、接入莖段基部愈傷組織橫向膨大(P=0.043)和縱向膨大(P=0)在不同種間達(dá)到顯著水平。從方差分量看，種的差異是影響各指標(biāo)分量的主要因素，各指標(biāo)種的方差分量在78.491% ～97.647%。增殖系數(shù)種方差分量為77.014%，這說明梓樹屬不同種瓶苗生長受較強(qiáng)的遺傳因素制約。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)多重比較及方差分量動態(tài)變化

各指標(biāo)不同培養(yǎng)時(shí)間方差分量(表1)顯示，增殖系數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的遞增，種間方差分量在逐漸減小;培養(yǎng)7～15 d，增殖分化芽數(shù)、增殖芽芽長隨培養(yǎng)時(shí)間遞增，種間方差分量在逐漸增大，葉數(shù)的分量在逐漸減小;15～25 d，芽數(shù)的分化與增殖芽的生長、莖段基部愈傷組織縱向膨大種間方差分量在逐漸減小，葉數(shù)、莖段基部愈傷組織橫向膨大卻在增大;培養(yǎng)25～35 d，芽的生長、莖段基部愈傷組織橫向膨大種間方差分量在逐漸減小，增殖芽的分化、葉數(shù)、愈傷組織縱向膨大卻在增大。結(jié)果說明，在培養(yǎng)過程中，種的差異是各指標(biāo)生長變化的主要因素，在不同的培養(yǎng)時(shí)間段影響程度不同。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間繼代培養(yǎng)各指標(biāo)分量變化

表2顯示，在同一培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)35 d后，滇楸增殖分化芽數(shù)最多為4.35個(gè)，種間由多到少為滇楸＞灰楸＞楸樹＞梓樹＞黃金樹;黃金樹增殖分化芽生長最快，為3.03 cm，由快到慢為黃金樹＞梓樹＞滇楸＞灰楸＞楸樹;增殖系數(shù)滇楸與灰楸、楸樹差異顯著，種間由高到低為滇楸＞梓樹＞黃金樹＞灰楸＞楸樹;葉數(shù)滇楸與其余4個(gè)種差異顯著，相對滇楸分化葉數(shù)最少為5.29個(gè)，梓樹最多為7.33;莖段基部愈傷組織橫向與縱向膨大的種間差異顯著，以灰楸膨大面積最大，為0.80 cm×1.01 cm。

表2 梓樹屬不同種繼代培養(yǎng)性狀比較

2.3 生根培養(yǎng)性狀及移栽成活率比較

由表3可知，培養(yǎng)30 d后，生根率黃金樹最高，為73.33%，滇楸最低，為25%，由高到低為黃金樹＞梓樹＞楸樹＞灰楸＞滇楸;發(fā)根數(shù)梓樹最高，為3.54個(gè)，滇楸最低，為 0.64;根長楸樹最長，為1.82 cm，灰楸最短，為0.86 cm;瓶苗生長以黃金樹最快，30 d后新發(fā)芽芽長為1.23 cm，楸樹最慢，為0.22 cm，由快到慢為梓樹＞黃金樹＞灰楸＞滇楸＞楸樹;移栽成活率黃金樹(85.5%)＞梓樹(82.4%)＞楸樹(70.4%)＞灰楸(56.3%)＞滇楸(43.3%)。

方差分析表明，再生芽生根指標(biāo)生根率(P=0)、生根數(shù)(P=0)、根長(P=0)、發(fā)芽數(shù)(P=0)、葉數(shù)(P=0.002)及生根苗生長速度(芽長P=0)在不同種間差異達(dá)到極顯著水平;觀測指標(biāo)方差分量生根率(96.381%)、生根數(shù)(97.647%)、根長(95.113%)、發(fā)芽數(shù)(95.669%)、芽長(96.274%)，除葉數(shù)量(89.966)外，都達(dá)到95%以上;這說明梓樹屬生根培養(yǎng)瓶苗生長指標(biāo)受較強(qiáng)的遺傳因素制約，各種在生長性狀上存在著豐富的遺傳變異，種的不同是影響生長性狀的主要因素。

表3 梓樹屬生根培養(yǎng)性狀比較

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞的全能性，通過一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用，誘導(dǎo)發(fā)育成完整的植株個(gè)體，已廣泛的應(yīng)用于苗木生產(chǎn)、種質(zhì)資源保存、轉(zhuǎn)基因體系的應(yīng)用等。珍貴闊葉樹種種質(zhì)創(chuàng)新課題組研究表明，在同等培養(yǎng)環(huán)境下，影響楸樹[11]無性系組培繁殖的主要因素是遺傳基因，外界條件在不同的培養(yǎng)階段亦有不同的影響，本試驗(yàn)研究表明，5個(gè)種的繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)生長指標(biāo)分量均達(dá)到90%左右，說明梓樹屬瓶苗生長指標(biāo)受較強(qiáng)的遺傳因素制約，各種在瓶苗生長性狀上存在著豐富的遺傳變異，種的不同是影響梓樹屬不同種組培繁殖生長性狀的主要因素;通過對組培繁殖瓶苗生長情況、生根率與移栽成活率比較，綜合表現(xiàn)以黃金樹較好。對同種不同無性系間對比研究的較多，北美懸鈴木[12]、杉木、桉樹[13]、楸樹已有相關(guān)研究報(bào)道，得出的結(jié)論基本類似，在同一培養(yǎng)環(huán)境下，無性系繁殖指標(biāo)受較強(qiáng)的遺傳因素制約。在相同的環(huán)境下，不同群體間的表型差異就反映了它們基因型的差異[14]，這說明種組培繁殖表型性狀的差異在一定的程度上表現(xiàn)出種間基因的遠(yuǎn)近，關(guān)于組培表型性狀與基因遠(yuǎn)近的研究少有報(bào)道，這還需進(jìn)一步深入研究。

“十一五”期間，珍貴闊葉樹種種質(zhì)創(chuàng)新課題組對灰楸、滇楸、楸樹、黃金樹、梓樹進(jìn)行了資源分布、田間表型性狀調(diào)查，并進(jìn)一步進(jìn)行了無性系選擇、目標(biāo)樹選擇和培育等研究，研究結(jié)果表明，梓樹屬分為3個(gè)組(灰楸、滇楸與楸樹為一組，黃金樹與梓樹為一組，紫葳楸為一組)。黃金樹、梓樹與紫薇楸主要以種子繁殖為主，種子結(jié)實(shí)率、發(fā)芽率較高，黃金樹、梓樹實(shí)生苗主要用于楸樹、灰楸優(yōu)良無性系的嫁接砧木;灰楸、楸樹種子結(jié)實(shí)率、發(fā)芽率都較低，主要以嫁接、組織培養(yǎng)繁殖，其生長迅速、材質(zhì)優(yōu)良是珍貴優(yōu)質(zhì)用材及庭院觀賞、道路綠化樹種。

林木組織培養(yǎng)分化主要指標(biāo)在于繼代增殖分化芽數(shù)、芽的生長、生根率與移栽成活率，本試驗(yàn)結(jié)論表明，這些指標(biāo)灰楸、滇楸、楸樹無性系性狀表現(xiàn)相近，梓樹與黃金樹相近，這與田間表現(xiàn)基本相同。大多研究表明，不同植物組織培養(yǎng)需要不同的配方與培養(yǎng)環(huán)境，很少有將同屬植物做組織培養(yǎng)對比分析研究，本試驗(yàn)研究表明，影響組培分化誘導(dǎo)與各生長性狀的主要因素是植物本身遺傳因素。根據(jù)細(xì)胞全能性原理，植物組培的遺傳因素完全與母本相同，林木植物組培所表現(xiàn)的表型性狀，一般都作為供試配方的篩選依據(jù)，從初代外植體誘導(dǎo)分化、繼代培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)及移栽煉苗性狀的表現(xiàn)，很少有研究將此列入育種選育的依據(jù)，只是輔助的擴(kuò)繁育種材料或?yàn)檗D(zhuǎn)基因做遺傳載體，組培性狀的表現(xiàn)能否作為林木遺傳育種選擇的依據(jù)，這還需大量的不同植物相關(guān)研究來做基礎(chǔ)，倘若能夠成立，這無疑能夠縮短育種進(jìn)程，推進(jìn)林木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，為拓寬組培應(yīng)用領(lǐng)域，在育種選擇過程中能否將植物組培與田間表型性狀的表現(xiàn)統(tǒng)一追蹤觀測，根據(jù)兩者數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，以得出相應(yīng)的基礎(chǔ)理論，為進(jìn)一步深入研究與發(fā)展做基奠，這還需相關(guān)研究領(lǐng)域的人員的涉及與深入。

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