中國(guó)東北部野生杏資源ISSR遺傳多樣性1)

馬麗娟 郭太君 何丹丹

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

李 鋒 張艷波

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所)

杏是世界上重要的果樹和觀賞樹種之一，在各大洲都有栽培。中國(guó)是杏的遺傳多樣性分布中心，具有豐富的種質(zhì)資源。我國(guó)東北部寒冷地區(qū)野生杏屬植物資源位于世界杏屬植物生態(tài)群的東北亞生態(tài)群[1]，典型的特征是果實(shí)小、核仁小、味苦，果肉可食性差;樹體抗寒力強(qiáng)，可耐－30℃以下的低溫，通常作為園林綠化樹種和栽培杏的砧木加以利用，也有少數(shù)用作杏抗寒育種的親本。東北野生杏主要是西伯利亞杏(Armeniaca sibirica(L.)Lam.)、遼 杏 (A.mandshurica(Maxim.)Skv.)或是帶有西伯利亞杏、遼杏、普通杏(A.vulgaris Lam.)血緣的雜合體。由于21世紀(jì)八十、九十年代人們對(duì)于土地的不當(dāng)利用、林地的開發(fā)和生態(tài)環(huán)境的惡化，使野生杏資源的數(shù)量急劇減少，物種的多樣性受到嚴(yán)重的威脅。本文利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)東北野生杏遺傳多樣性分析，以期獲得東北野生杏居群遺傳變異情況，為居群劃分、優(yōu)良品種培育及野生資源保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

材料來自黑龍江的林口(LK)、東寧(DN)、興凱湖(XKH)和吉林通榆(TY)4個(gè)野生杏居群共176份樣本。其中通榆居群位于亞洲最大的野生西伯利亞杏林，林口居群、東寧居群可能是野生西伯利亞杏，興凱湖居群可能是野生遼杏。每個(gè)居群根據(jù)杏樹分布范圍選取樣株，于野外取幼嫩葉片低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍后－80℃保存?zhèn)溆谩楸ＷC重復(fù)取樣，對(duì)每株樣樹的形態(tài)(樹高、胸徑/株型、生境)進(jìn)行記錄和拍照并做好標(biāo)記。采樣點(diǎn)地圖見圖1，每個(gè)居群的產(chǎn)地、生境及采樣數(shù)見表1。

1.1 ISSR－PCR 體系及擴(kuò)增

DNA提取和檢測(cè)按文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。試驗(yàn)所用ISSR引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，從40條ISSR引物中篩選出12條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物用于全部樣本的PCR擴(kuò)增。ISSR－PCR反應(yīng)體系經(jīng)比較和優(yōu)化確定為20 μL，其中模板 DNA 2 μL(20 ng/μL)，10×buffer 2 μL，超純 dNTP 1.6 μL(2.5 mmol/L)，引物 1 μL(10 μm/L)，Taq DNA 聚合酶 0.4 μL(2.5 U/μL)，雙蒸水 13 μL。擴(kuò)增程序參考[1]:94 ℃ 預(yù)變性 5 min;94℃變性45 s，51～59℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，共40個(gè)循環(huán);72℃后延伸7 min;擴(kuò)增后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物(6 μL PCR產(chǎn)物)用含EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外凝膠成像儀下觀察拍照。

表1 4個(gè)野生杏居群基本生境條件

圖1 野生杏居群采樣點(diǎn)示意圖

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

由于ISSR是顯性標(biāo)記，在相同電泳遷移位置的條帶具有同源性。用DL2000Maker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)獲得的電泳條帶進(jìn)行0、1編碼，有帶(包括弱帶)記為“1”，無帶記為“0”，建立0、1原始矩陣。采用 POPGENE1.32[3]軟件對(duì)各居群和全部個(gè)體進(jìn)行遺傳參數(shù)分析。分別計(jì)算了多態(tài)性條帶百分率(BPP)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣度(H)、Shannon’s信息指數(shù)(Ho)，總的遺傳多樣性(Ht)、居群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)(Gst=1－Hs/Ht)和基因流(Nm，gene flow)，Nei’s遺傳距離(D)與遺傳一致度(I)。利用 NTSYS－pc2.10[4]軟件，依據(jù)樣品的Nei’s遺傳距離和Nei＆Li相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA(非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增結(jié)果

從40條ISSR引物中篩選出的12條效果好的ISSR引物，對(duì)4居群176個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2。12條引物產(chǎn)生的清晰條帶在9～18條，共擴(kuò)增出180條帶，多態(tài)性條帶149條，占82.8%，平均每個(gè)引物的擴(kuò)增條帶為15條;不同引物產(chǎn)生的多態(tài)性百分比在73.3% ～100%(表2)，表明12條ISSR引物均具有較高的多態(tài)性。其中引物UBC855擴(kuò)增多態(tài)性最高為100%，引物UBC881擴(kuò)增多態(tài)性最低為73.3%。

表2 對(duì)野生杏4個(gè)居群176個(gè)樣本進(jìn)行ISSR擴(kuò)增的引物序列擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性

評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性水平或等位基因豐富程度的指標(biāo)主要有多態(tài)性百分率、Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù)、有效等位基因數(shù)。本研究結(jié)果如表3所示:4個(gè)居群中多態(tài)性百分率、Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù)變化均以興凱湖居群(XKH)最高，林口居群(LK)最低，通榆居群(TY)、東寧(DN)居中;表明XKH居群野生遼杏的遺傳多樣性高于野生西伯利亞杏。野生杏個(gè)體水平的多態(tài)性百分率、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣度和Shannon 信息指數(shù)分別為 82.8%、1.4096、0.2471、0.3799，均高于居群范圍52.8% ～73.9%、1.2947 ～1.3836、0.1728 ～0.2269、0.2608 ～0.3456。

圖2 引物UBC843對(duì)東寧居群(DN)25－41號(hào)樣本擴(kuò)增結(jié)果

野生杏個(gè)體總的遺傳多樣性為0.2468，而居群內(nèi)的遺傳多樣性為0.2043，4個(gè)居群間的基因分化系數(shù)為0.1720。居群間遺傳變異和居群內(nèi)的遺傳變異分別占總遺傳變異的17.2%和82.8%，表明遺傳變異主要存在于居群內(nèi)部。居群間基因流為 2.4063。

表3 4個(gè)野生杏居群的遺傳多樣性指數(shù)

2.3 遺傳關(guān)系聚類

為了分析不同居群間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，計(jì)算了不同居群間的 Nei’s遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)[5]列于表4。可以看出I值變化范圍是0.9041～0.9711，均大于0.9，說明4個(gè)居群的親緣關(guān)系很接近。其中TY和DN的遺傳一致度最大，說明這兩個(gè)居群的親緣關(guān)系最近，TY和LK的遺傳一致度最小，說明TY和LK親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表4 4個(gè)野生杏居群的Nei’s遺傳一致度和遺傳距離的關(guān)系

根據(jù)Nei’s遺傳距離利用UPGMA法構(gòu)建的居群遺傳關(guān)系聚類圖見圖3。

圖3 4個(gè)野生杏居群間Nei’s遺傳距離的UPGMA聚類圖

為了闡明供試杏樣品之間是否存在基因交流，進(jìn)行了176個(gè)樣本基于Nei＆Li遺傳相似性系數(shù)的聚類分析(圖4)。從圖中可以看出在相似系數(shù)0.745處截取聚類線，可將176份樣本分成3大組:第1組包含TY居群和DN居群81個(gè)西伯利亞杏樣本，兩居群間存在基因交流，或存在同源性基因。第2組包含XKH居群的XKH1－XKH65的65個(gè)遼杏樣品，其在0.785處截取聚類線分成5個(gè)亞組(亞組Ⅰ、亞組Ⅱ亞組Ⅲ、亞組Ⅳ、亞組Ⅴ)，表明XKH居群遼杏具有豐富的遺傳變異。第3組包含XKH居群的XKH66－XKH79和LK居群全部樣本，包含兩個(gè)種(遼杏和西伯利亞杏)，表明LK居群和XKH居群的親緣關(guān)系較近;其中XKH居群在相似系數(shù)0.785處又分為兩個(gè)亞組(亞組Ⅵ、亞組Ⅶ)。

2.4 遺傳多樣性指數(shù)與氣候和地理相關(guān)性

將各項(xiàng)遺傳參數(shù)與相關(guān)影響因子進(jìn)行分析(表5)。可以看出無霜期與各種遺傳參數(shù)相關(guān)性程度很高，相關(guān)系數(shù)均大于60%;緯度和年均氣溫與遺傳一致度I和遺傳距離D有明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)大于60%。

圖4 基于Nei＆Li遺傳相似性系數(shù)的野生杏176個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類圖

表5 居群遺傳參數(shù)與影響因子的相關(guān)性

3 討論

遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一，是生物各分支學(xué)科重要的背景資料，本試驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)我國(guó)東北部野生杏進(jìn)行了遺傳多樣性分析，表明居群遺傳多樣性指數(shù)(多態(tài)性百分率、Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù))均以興凱湖居群(XKH)野生遼杏最高，林口居群(LK)野生西伯利亞杏最低，其中XKH居群樣品在聚類圖中顯示0.785處分為7個(gè)亞組，表明野生遼杏的遺傳多樣性程度較高。根據(jù)Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù)對(duì)野生西伯利亞杏3個(gè)居群遺傳多樣性進(jìn)行排列得出:TY＞DN＞LK。居群遺傳多樣性和影響因子相關(guān)分析表明:地理緯度、無霜期、年均氣溫與遺傳多樣性相關(guān)程度較高。將本研究結(jié)果(H=0.2471，Ho=0.3799)與前人對(duì)普通杏群體[6]和伊犁野生杏種群[7]研究結(jié)果比較，表明東北野生杏遺傳多樣性程度高于普通杏群體，但低于伊犁野生杏種群。與伊犁野生杏種群[7]居群內(nèi)遺傳分化比較，東北地區(qū)野生遼杏和西伯利亞杏種內(nèi)(居群內(nèi))遺傳變異較高，具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。居群間的基因流為2.4063，介于伊犁野杏種群和新疆杏品種群之間[7－8]。產(chǎn)生這些變化的原因，一方面是4個(gè)居群地理位置不同，導(dǎo)致年均氣溫、無霜期等氣候環(huán)境差異，影響了居群間的基因交流;另外是東北地區(qū)冬季漫長(zhǎng)、氣候干寒，春秋兩季溫度變化劇烈，野生杏為適應(yīng)惡劣的自然環(huán)境而產(chǎn)生的遺傳變異的結(jié)果。

居群間聚類分析表明:TY居群與DN居群、XKH居群親緣關(guān)系較近，與LK居群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。樣本間的聚類同樣表明:TY和DN親緣關(guān)系較近，聚在同一組，兩個(gè)居群內(nèi)部存在基因交流。XKH居群部分樣品和LK居群聚在一組，表明兩居群親緣關(guān)系較近，其中LK居群的LK7號(hào)西伯利亞野生杏與XKH居群的XKH72－XKH79號(hào)遼杏聚為同一個(gè)亞組，表明兩地的野生杏親緣關(guān)系較近，而與同居群的其他個(gè)體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過地理研究發(fā)現(xiàn)林口處于老爺嶺和完達(dá)山的交接處，興凱湖西北岸聳峙著完達(dá)山，興凱湖湖崗在歷史形成中發(fā)生過多次變遷，周圍地區(qū)的完達(dá)山等山脈在歷次構(gòu)造中也發(fā)生變化。其親緣關(guān)系較近的原因可能是由于LK與XKH居群在進(jìn)化歷史中存在繁殖體的遷移而產(chǎn)生種間雜交所致，有待繼續(xù)考證。

物種的穩(wěn)定性和進(jìn)化的潛力依賴其遺傳多樣性，本研究從分子水平證明了東北地區(qū)野生遼杏和西伯利亞杏存在豐富的種內(nèi)遺傳多樣性變化，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行復(fù)雜性狀的定位和相關(guān)基因研究，并結(jié)合形態(tài)觀察，挖掘更多特異性種質(zhì)，為新品種選育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)野生杏所處環(huán)境較差，缺乏人為養(yǎng)護(hù)管理，建議加強(qiáng)對(duì)東北野生杏資源的原生境保護(hù)和遷地保護(hù)，防止珍惜資源的流失。

[1]張加延，張釗.中國(guó)果樹志:杏卷[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2003.

[2]謝佳，郭太君，李鋒，等.杏92份種質(zhì)資源的ISSR分析[J].中國(guó)果樹，2011(2):14－18.

[3]Yeh F C，Yang R C，Boyle T B，et al.Pop gene version 1.31 the user friendly shareware for population genetic analysis[M].Edmonton:Molecular Biology and Biotechnology Centre University of Alberta，1997.

[4]Rohlf F J.NTSYS-PC version 2.10[M].New York:Applied Biostatistics Inc，1994.

[5]Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics，1978，89(3):583－590.

[6]苑兆和，陳學(xué)森，何天明，等.中國(guó)南疆栽培杏群體遺傳結(jié)構(gòu)的熒光 AFLP 分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2007，34(11):1037－1047.

[7]何天明，陳學(xué)森.利用SSR標(biāo)記對(duì)伊犁河谷野杏種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.北京:中國(guó)園藝學(xué)會(huì)，2005.

[8]何天明，陳學(xué)森，高疆生，等.新疆栽培杏群體遺傳結(jié)構(gòu)的SSR分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33(4):809－812.