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    椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物提取條件優(yōu)化

    2013-09-17 07:22:06唐韻熙鄧放明
    食品與機(jī)械 2013年6期
    關(guān)鍵詞:水楊酸鈉苦素類(lèi)物質(zhì)

    唐韻熙鄧放明

    TANG Yun-xi1,2DENG Fang-ming1,2

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)四環(huán)三萜類(lèi)植物次生代謝物質(zhì),主要存在于蕓香科和楝科植物組織中[1],以果核中含量較高,果皮次之,果汁中含量最低。至今發(fā)現(xiàn)柑桔果實(shí)中較常見(jiàn)且含量較高的檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)主要有:檸檬苦素、諾米林、奧巴叩酮、脫乙酰諾米林等[2]。檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)有苷元和糖苷兩種存在形式,至今已從柑橘屬植物中分離出了37種類(lèi)檸檬苦素苷元和17種類(lèi)檸檬苦素糖苷[3]。類(lèi)檸檬苦素苷元的結(jié)構(gòu)為D-環(huán)的C17位上連一個(gè)呋喃環(huán),而且具有高度氧化的三萜醇類(lèi)誘導(dǎo)體結(jié)構(gòu),而糖苷是由檸檬苦素類(lèi)似物苷元分子D環(huán)開(kāi)環(huán)后在C17位上和一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合而成的[4]。國(guó)外對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的研究較為深入,據(jù)報(bào)道[5],早在20世紀(jì)60年代,Arigoni和Barton就用化學(xué)和X-ray的方法對(duì)檸檬苦素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,指出檸檬苦素的分子式為C26H30O8,分子量為470。同時(shí)由于檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的苷元和糖苷兩種結(jié)構(gòu)決定了其具有一定的健康維護(hù)功能,因此學(xué)者[6,7]對(duì)其進(jìn)行了分離、鑒定和生物活性探討。Murthy等[8]發(fā)現(xiàn)柑橘中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)和姜黃素能夠抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。Archana等[9]用石油醚對(duì)Citrus medica Linn.種子進(jìn)行檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取,并以大白鼠為受體,研究表明,檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)能明顯降低大鼠體內(nèi)血清膽固醇、血清甘油三酯的含量,提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量,這有助于降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。另有研究[10,11]指出檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)還有降血糖、殺蟲(chóng)、抗病毒、抗腫瘤形成和抑菌等作用。

    目前,對(duì)于檸檬苦素類(lèi)似物的提取、分離、純化和鑒定已有一定的研究,常用的提取方法主要有超聲波輔助提取法[12]、溶劑提取法[13]、超臨界 CO2提取法[14]等。其常使用乙醇或丙醇等有機(jī)物作為提取劑,但使用量大且對(duì)環(huán)境有一定污染,特別是丙醇等毒性有機(jī)物。Deepak等[15]曾采用水溶助劑法對(duì)酸橘籽中具有生物活性的檸檬苦素進(jìn)行了研究,結(jié)果表明該方法可減少有機(jī)溶劑用量且提取率較好。本研究在此基礎(chǔ)上,選擇水楊酸鈉水溶助劑進(jìn)行提取,擬對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,旨在找到一種環(huán)境友好型且提取率高的方法,為柑桔類(lèi)水果的深加工提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    椪柑核:于湖南長(zhǎng)沙水果市場(chǎng)采購(gòu)椪柑并取籽,洗凈,50℃下烘干,用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩,保存于干燥環(huán)境中備用;

    檸檬苦素標(biāo)樣:純度98%,成都曼思特生物科技有限公司;

    水楊酸鈉、石油醚(60~90℃)、無(wú)水乙醇、濃硫酸、三氯化鐵、對(duì)二-甲氨基苯甲醛:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    顯色液(Ehrlich試劑):A液:準(zhǔn)確稱(chēng)取125mg對(duì)二-甲氨基苯甲醛溶于100mL的濃硫酸和乙醇混合液(濃硫酸65mL,乙醇35mL)中;B液:準(zhǔn)確稱(chēng)取氯化鐵0.9g,用蒸溜水溶解并定容至100mL,使用時(shí)A液中加入0.5mL的B液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.2 儀器

    可見(jiàn)分光光度計(jì):WFJ7200型,上海龍尼柯儀器有限公司;

    高速中藥粉碎機(jī):ZN-400A型,長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械;

    電熱恒溫水浴鍋:DZKW-S-4型,北京市永光明醫(yī)療儀器廠;

    循環(huán)水式多用真空泵:SHB-ⅢT型,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;

    電熱鼓風(fēng)干燥箱:101-2AB型,天津市泰斯特儀器有限公司;

    電子分析天平:AUY220型,日本Shmadzv公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 椪柑核檸檬苦素的測(cè)定

    (1)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)樣品,用50mL無(wú)水乙醇溶解、定容,配制成200μg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中,加無(wú)水乙醇1mL,再加顯色液5mL,搖勻,于暗處?kù)o置30min,然后在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,并以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)作圖,觀察到最大吸收峰波長(zhǎng)在490nm處。

    (2)檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取0,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50,1.75,2.00mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中,并分別用無(wú)水乙醇稀釋至2mL,再分別加入5.0mL顯色液,搖均,暗處?kù)o置30min。用無(wú)水乙醇作為空白參比,在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)得結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,檸檬苦素標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)x,吸光度為縱坐標(biāo)y。最終得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.004 1x-0.097 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.993 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

    圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 The standard curve of Limonin

    (3)檸檬苦素提取得率的計(jì)算:將椪柑核檸檬苦素提取液定容到50mL,準(zhǔn)確吸取0.1mL于10mL試管中,準(zhǔn)確加入1.9mL無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)偌尤?mL顯色液,于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品液的吸光度,然后根據(jù)吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得檸檬苦素類(lèi)似物濃度,最后計(jì)算待測(cè)樣品中檸檬苦素類(lèi)似物的含量,其計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

    式中:

    R——椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物含量,%;

    V——樣品定容體積,mL;

    C—— 測(cè)得的樣品濃度,μg/mL;

    L——加入的樣品體積,mL;

    M—— 樣品質(zhì)量,g。

    1.3.2 提取椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物的操作方法

    (1)椪柑核脫脂:稱(chēng)取一定量椪柑核粉,按料液比1∶4(m∶V)倒入適量石油醚,密封好于室溫下浸提24h。而后抽濾自然干燥至無(wú)石油醚。

    (2)水溶助劑提取檸檬苦素:稱(chēng)取脫脂椪柑核粉2g(精確至0.000 1g)于100mL錐形瓶中,按料液比加入一定量的水溶助劑水楊酸鈉,于一定溫度下浸提一定時(shí)間,然后抽濾,用提取溶劑定容至50mL,即得椪柑核檸檬苦素提取液。

    1.3.3 椪柑核檸檬苦素提取單因素試驗(yàn)

    (1)提取時(shí)間篩選試驗(yàn):稱(chēng)取2.0g(精確至0.000 1g)樣品粉末5份,在濃度為2mol/L的水楊酸鈉20mL,溫度為40℃下,分別浸提2,4,6,8,10h后,抽濾,定容至50mL,按1.3.1(2)法進(jìn)行顯色反應(yīng),在490nm處測(cè)定吸光度,通過(guò)計(jì)算檸檬苦素類(lèi)似物得率,觀察浸提時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物提取率的影響。

    (2)提取劑濃度篩選試驗(yàn):稱(chēng)取2.0g(精確至0.000 1g)樣品粉末5份,在40℃下提取6h,用濃度分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mol/L的水楊酸鈉20mL進(jìn)行提取,待提取完后,抽濾,定容至50mL,按1.3.1(2)法進(jìn)行顯色反應(yīng),在490nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算得率,觀察提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物溶出的影響。

    (3)提取溫度篩選試驗(yàn):稱(chēng)取2.0g(精確至0.000 1g)樣品粉末5份,用20mL濃度為2mol/L的水楊酸鈉,分別在20,30,40,50,60℃下浸提6h,過(guò)濾,加提取試劑定容至50mL,按1.3.1(2)法進(jìn)行顯色反應(yīng),在490nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算得率,觀察提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物提取率的影響。

    (4)料液比篩選試驗(yàn):稱(chēng)取2.0g(精確至0.000 1g)樣品粉末5份,按料液比1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25(m∶V)加入濃度為2mol/L的水楊酸鈉,在40℃下浸提6h,過(guò)濾,定容至50mL,按1.3.1(2)法進(jìn)行顯色反應(yīng),在490nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算得率,觀察料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物溶出的影響。

    1.3.4 椪柑核檸檬苦素提取正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選用提取時(shí)間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗(yàn)因素,進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn),以檸檬苦素得率為指標(biāo),確定最佳提取條件,并確定各因素的影響重要性次序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

    由圖2可知,隨著提取時(shí)間由2h延長(zhǎng)到6h,檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率逐漸增大,提取6h后出現(xiàn)了緩慢下降的趨勢(shì),這可能是由于浸提時(shí)間延長(zhǎng),溶劑中有效成分發(fā)生分解氧化現(xiàn)象從而降低了得率。因此,提取時(shí)間選取6h左右比較適宜。

    圖2 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure2 Effects of extracting time on extraction yield of Limonin

    2.2 提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

    由圖3可知,隨著水楊酸鈉濃度由1mol/L增加到2mol/L,檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì),在2mol/L時(shí)達(dá)到最高。但在2mol/L以后,隨水楊酸鈉濃度升高,檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率稍有降低,這可能是因?yàn)槠湓?mol/L的水楊酸鈉內(nèi)已達(dá)到飽和,濃度過(guò)大反而影響檸檬苦素類(lèi)似物的提取率。同時(shí)也考慮到水溶助劑濃度升高,會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)品中非目標(biāo)成分的增加,影響目標(biāo)物純度,因此,提取溶劑濃度選取2mol/L左右比較適宜。

    圖3 提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure3 Effects of extractant concentration on extraction yield of Limonin

    2.3 提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

    一般情況下,物質(zhì)在溶劑中的溶解度會(huì)因溫度的提高而增加,但檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)作為一種天然抗氧化物質(zhì),在高溫條件下被氧化的概率也相應(yīng)增加,致使提取效率降低。由圖4可知,提取溫度從20℃提升到40℃,檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì),在40℃時(shí)達(dá)到最高。而后提取率有所下降,因此提取溫度選取40℃左右為宜。

    圖4 提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure4 Effects of extracting temperature on extraction yield of Limonin

    2.4 料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

    溶劑用量的多少和檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)在其中的溶解率有一定的關(guān)系。由圖5可知,檸檬苦素的提取率是隨著料液比的提高而增加的。但是料液比到達(dá)1∶15(m∶V)后,上升趨勢(shì)不明顯,此時(shí)溶劑可能已經(jīng)將待提取物全部提取出。從節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本角度出發(fā),選擇料液比1∶15(m∶V)左右為宜。

    圖5 料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure5 Effects of ratio of material to extractant on extraction yield of Limonin

    2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    為了優(yōu)化椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物提取條件,以檸檬苦素得率為指標(biāo),選用提取時(shí)間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平取值見(jiàn)表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。

    由表2可知,用水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的最佳條件為A2B2C2(C1)D3,即提取時(shí)間為6h,提取溶劑濃度為2mol/L,提取溫度為40℃(或30℃),料液比為1∶20(m∶V)。各因素對(duì)椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響依次為D>B>A>C,即料液比>提取劑濃度>提取時(shí)間>提取溫度。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Design of factors and levels for L9(34)orthogonal test

    表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表Table2 The result of L9(34)orthogonal test

    表3 方差分析表?Table3 Analysis of variance table

    由表3可知,不同料液比的試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

    依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,在兩組最優(yōu)條件(即1:A2B2C2D3;2:A2B2C1D3)下進(jìn)行水溶助劑法提取椪柑核檸檬苦素重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,兩組得到的檸檬苦素平均得率分別為4.21%,4.19%。因此,根據(jù)實(shí)際條件,最終選擇組1(A2B2C2D3)為最佳檸檬苦素提取條件。

    3 結(jié)論

    以椪柑核為原料,用水溶助劑水楊酸鈉為提取溶劑,研究椪柑核中檸檬苦素提取的優(yōu)化工藝條件。經(jīng)優(yōu)化后,水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素的最佳提取條件為提取時(shí)間6h、水楊酸鈉濃度2.0mol/L、溫度40 ℃、料液比1∶20(m∶V),在此條件下,椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率為4.21%。該方法也證實(shí)了前人對(duì)于水溶助劑提取檸檬苦素類(lèi)似物可明顯減少有機(jī)溶劑用量的論證,且對(duì)環(huán)境的污染性小。但該方法只是采用椪柑核種子作為研究對(duì)象,在下一步的研究中,應(yīng)擴(kuò)大柑橘品種的選取面,針對(duì)果皮、果肉等不同部位進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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