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    籽瓜種子蛋白質(zhì)組成及其提取工藝優(yōu)化的研究

    2013-09-17 12:32:26郭曉飛趙曉燕
    中國糧油學(xué)報(bào) 2013年9期
    關(guān)鍵詞:籽瓜花生氨基酸

    張 超 郭曉飛 李 武 馬 越 王 丹 趙曉燕

    (北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097)

    籽瓜(Citrullus vulgaris L.),又名打瓜,屬葫蘆科一年生草本植物,原產(chǎn)地為非洲西南部卡拉哈迪沙漠中。我國籽瓜種植主要分布在甘肅、內(nèi)蒙、新疆等地區(qū),年產(chǎn)量超過百萬噸[1]。籽瓜種子蛋白質(zhì)含量為36% ~40%,其必需氨基酸除賴氨酸外均達(dá)到或超過FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)推薦的標(biāo)準(zhǔn)[2-3],是一種優(yōu)良的植物蛋白資源。研究表明籽瓜種子蛋白質(zhì)除了可作為人體外源性蛋白質(zhì)優(yōu)良補(bǔ)充劑外,其還可以高效螯合鋅離子和鐵離子,從而幫助人體補(bǔ)充礦物質(zhì)[4]。近年來,花生[5]、椰子[6]、杏仁[7]和沙棘[8]等的蛋白質(zhì)均采用堿溶酸沉法的取得良好的提取效果,而籽瓜種子的研究主要集中在促進(jìn)其萌芽方法及其健康生產(chǎn)的研究,僅張玉秀等[2]對(duì)其氨基酸和脂肪酸組成進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和比較。

    本研究在前人的基礎(chǔ)上,對(duì)民籽1號(hào)籽瓜種子蛋白質(zhì)的基本組成進(jìn)行分析,評(píng)估其氨基酸組成;并利用響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化其蛋白質(zhì)提取工藝,通過回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè),獲得最優(yōu)工藝條件,為其后續(xù)對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)的功能評(píng)價(jià)、功能肽的研究奠定夯實(shí)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    籽瓜種子:民籽1號(hào),甘肅省民勤縣金谷源農(nóng)業(yè)科技有限公司;大豆、花生、葵花籽:市售;乙醚沸程(30~60℃),氫氧化鈉,濃鹽酸,硫酸銅,硼酸,酒石酸鉀鈉均為分析純(AR):北京化工廠;酪蛋白:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;福林酚試劑:美國Sigma公司。

    1030 Analyzer凱氏定氮儀:瑞士 Tetator公司;FE20pH計(jì):瑞士Mettler Toledo公司;3-18K冷凍離心機(jī):德國Sigma公司;UV-1800紫外可見分光光度儀:日本島津公司;ALPHA2-4LD冷凍干燥機(jī):德國Chirst公司。

    1.2 籽瓜種子組成檢測(cè)方法

    蛋白質(zhì)含量測(cè)定依據(jù) GB/T 5009.5—2010采用凱氏定氮法;提取液中蛋白質(zhì)采用福林-酚比色法測(cè)定[9];粗脂肪含量測(cè)定依據(jù) GB/T 14772—2008采用索氏提取法進(jìn)行測(cè)定;水分含量依據(jù)GB/T 5009.3—2010采用常壓干燥法進(jìn)行測(cè)定;灰分含量測(cè)定依據(jù)GB/T 5009.4—2010采用干法灰化法測(cè)定;氨基酸組成參考GB/T 5009.124—2003采用氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定。

    1.3 脫脂籽瓜種子粉的制備

    利用萬能粉碎機(jī)對(duì)籽瓜種子進(jìn)行粉碎處理,然后按1∶4的比例使用乙醚對(duì)籽瓜種子脫脂,脫脂溫度為50℃,時(shí)間為8 h;然后把籽瓜種子粉置于通風(fēng)櫥中干燥8 h,再置于鼓風(fēng)干燥機(jī)50℃干燥12 h。

    1.4 籽瓜種子蛋白質(zhì)的提取工藝

    籽瓜種子粉按1∶10加入去離子水,調(diào)節(jié)pH值(0.5 mol/L 的 HCl或 0.5 mol/L 的 NaOH),在水浴中攪拌,3 500 r/min下離心15 min,調(diào)節(jié)上清液至pH 5.0(預(yù)試驗(yàn)證明籽瓜種子蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH 5.0附近),離心棄去上清液得洗沉淀,調(diào)節(jié)體系至pH 7.0,冷凍干燥獲得籽瓜種子蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的提取率采用公式1進(jìn)行計(jì)算。

    1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在溫度為35℃,時(shí)間60 min,考察不同pH值(8、9、10、11和12)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響;在pH為11,時(shí)間為 60 min,考察不同溫度(25、35、45、55 和65℃)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響;在 pH 11,溫度為55 ℃,考察不同時(shí)間(30、45、60、75 和 90 min)對(duì)提取率的影響。

    1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其驗(yàn)證性試驗(yàn)

    利用Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取pH、溫度和浸提時(shí)間3個(gè)主因素,設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn),考察不同因素水平對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。因素水平表見表1。以響應(yīng)面得到的最佳工藝條件提取籽瓜種子蛋白質(zhì),考察實(shí)際提取率與預(yù)測(cè)值之間的差異。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析

    利用Oring 8.0(美國Origin Lab公司)對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像繪制;采用Design-Expert V8(美國Stat-easy公司)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),并利用此軟件進(jìn)行F檢驗(yàn),考察各因素及交互作用的顯著性,置信區(qū)間為95%。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 籽瓜種子組成分析

    表2為籽瓜種子、大豆、花生和葵花籽的基本成分分析結(jié)果,籽瓜種子蛋白質(zhì)為36.2%,高于其他3種作物。同時(shí)其脂肪含量為45.7%,高于大豆。Wani等[10]測(cè)定籽瓜種子常規(guī)成分,粗蛋白和粗脂質(zhì)含量分別為16.34%和21.93%,二者的差異較大,產(chǎn)生的原因可能在于籽瓜的品種、生長(zhǎng)氣候和環(huán)境所造成的。

    表2 籽瓜種子、花生、大豆和葵花籽基本成分分析

    表3為籽瓜種子、大豆、花生和葵花籽的必需氨基酸組成分析結(jié)果,籽瓜種子蛋白中富含人體必需氨基酸,從必需氨基酸含量來看,大豆的最高,其次為籽瓜種子、葵花籽和花生,它們的含量分別為13.8%、11.6%、10.1% 和 9.11%,籽瓜種子的氨基酸組成與大豆的氨基酸組成較相似,但幾種作物必需氨基酸含量顯著低于FAO/WHO(1973 FAO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn))的必需氨基酸均衡模式,但籽瓜種子蛋白必需氨基酸配比適宜;籽瓜氨基酸組成與張玉秀等研究結(jié)果存在一定差異,可能在于不同品種及生長(zhǎng)的環(huán)境所造成的[2]。

    表3 必需氨基酸組成分析

    2.2 pH對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

    料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響不明顯,因而試驗(yàn)均采用1∶10的料液比。圖1顯示不同pH對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10,提取溫度為35℃,時(shí)間為60 min)。提取率隨pH的提高呈上升的趨勢(shì),當(dāng)pH達(dá)到11時(shí),蛋白質(zhì)的提取率趨于穩(wěn)定。在pH 11時(shí),蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到50.7%。籽瓜種子蛋白主要為球蛋白[11],因而隨著環(huán)境pH的提高,球蛋白從籽瓜種子組織中擴(kuò)散出來[12];隨著體系氫氧化鈉濃度的提高可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)有一定的裂解作用[13],因而促使pH 12時(shí)的提取率略小于 pH 11的體系。選定pH 11為響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

    圖1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

    2.3 溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

    圖2 顯示溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10,pH 11,浸提時(shí)間為60 min)。隨著浸提溫度的提高,提取率呈明顯的上升趨勢(shì),在浸提溫度達(dá)到55℃時(shí),蛋白質(zhì)提取率可達(dá)61.2%;溫度的升高加速分子間的擴(kuò)散,獲得更多的蛋白質(zhì),同時(shí)也會(huì)使蛋白質(zhì)變性,影響提取率[8]。在西紅柿種子蛋白[14]、花生蛋白質(zhì)[15]、南瓜子蛋白質(zhì)[16]和沙棘蛋白質(zhì)[8]制備過程中,都呈現(xiàn)出隨溫度升高提取率先升高后下降的趨勢(shì)。因此選定55℃為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

    圖2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

    2.4 時(shí)間對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

    圖3 顯示時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10,pH 11,浸提溫度為55℃)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì),當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到75 min時(shí),逐漸趨于動(dòng)態(tài)的平衡;繼續(xù)提高浸提時(shí)間,對(duì)提取效率影響不大??紤]到節(jié)約成本、降低能源消耗,選擇75 min為宜。

    圖3 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

    2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果

    進(jìn)一步采用Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)優(yōu)化蛋白質(zhì)工藝參數(shù),并用二次方程來表征因素水平與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型:

    式中:Y 為測(cè)定的響應(yīng)值;b0、bi、bii和 bij為二次回歸模型中的常數(shù)項(xiàng);Xi、Xj為不同變量的水平。其中每一個(gè)因素可分為線性部分、二次項(xiàng)部分和交互項(xiàng)部分,用來評(píng)估回歸方程的擬合效果,通過F檢驗(yàn)考察各因素及交互作用的顯著性[17]。表4為試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其對(duì)應(yīng)的提取率。

    表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

    利用Design Expert軟件對(duì)自變量編碼進(jìn)行回歸分析,得如下回歸方程:Y=0.64+0.016X1+0.012 X2+8.175E -003X3-5.500E -003X1X2-5.100E -003X1X3-3.750E -003X2X3-0.013X12-6.655E -003X22-0.012X32。并利用 Design-Expert軟件進(jìn)行F檢驗(yàn),考察各參數(shù)及其交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性程度。此回歸模型的變異系數(shù)和決定系數(shù)分別為1.46%和92.69%,表明該預(yù)測(cè)模型可較好反應(yīng)試驗(yàn)的真實(shí)情況;由方差分析表(表5)可知,時(shí)間對(duì)提取率的影響顯著(P<0.05),且溫度和pH對(duì)提取率影響極顯著(P<0.01);但溫度與浸提時(shí)間,溫度與pH和pH與時(shí)間交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著;由方差分析表可知,各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度依次為pH>溫度>時(shí)間。

    表5 回歸模型的方差分析

    響應(yīng)面圖可以直觀的反映不同因素對(duì)響應(yīng)值的影響[18],圖4~圖6分別表示不同因素交互作用提取率的影響,比較圖4~圖6可知,溫度和pH的交互作用的響應(yīng)面圖最為陡峭,其次為時(shí)間與pH的交互作用;圖像的陡峭與否可以直觀放映各因素對(duì)試驗(yàn)的影響程度[19]。利用Design-Expert軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行求解,獲得最優(yōu)提取率為66.8%,把應(yīng)的編碼值其轉(zhuǎn)化為實(shí)際值,即pH 11.5、浸提溫度61.5℃、時(shí)間 77.0 min。

    圖4 溫度與pH的交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖

    圖5 時(shí)間與pH的交互作用對(duì)提取影響的響應(yīng)面圖

    圖6 時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖

    2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

    為考察數(shù)據(jù)的真實(shí)性,采用相應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取條件對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)進(jìn)行提取,試驗(yàn)重復(fù)3次,其蛋白質(zhì)提取率平均值為64.5%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為3.44%,該模型準(zhǔn)確、可靠。

    3 結(jié)論

    對(duì)籽瓜種子的基本組成和氨基酸組成進(jìn)行評(píng)價(jià),表明籽瓜種子為優(yōu)良蛋白質(zhì)資源;利用單因素和中心組合試驗(yàn),獲得其蛋白質(zhì)的最佳提取工藝為pH 11.5、溫度61.5 ℃和時(shí)間77 min,該模型準(zhǔn)確、可靠,可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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