重組表達(dá)人載脂蛋白(a)羧基末端kringle結(jié)構(gòu)域抑制新生血管

申 樂，陳保生，薛 紅

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100730)

載脂蛋白(a)［Apolipoprotein(a)，Apo(a)］是脂蛋白(a)［lipoprotein(a)，Lp(a)］重要組成部分，其結(jié)構(gòu)中存在多個高度重復(fù)的kringleⅣ結(jié)構(gòu)域與1個kringleⅤ結(jié)構(gòu)域，分別與纖溶酶原的kringle 4結(jié)構(gòu)域與kringle 5結(jié)構(gòu)域同源［1］。很多kringle結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)都具有抑制新生血管的能力，如纖溶酶原［2］、尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)［3］、肝細(xì)胞生長因子/分散因子(HGF/SF)等［4］。對 Apo(a)的研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)kringleⅤ結(jié)構(gòu)域與重組表達(dá)kringleⅣ9型-10型-kringleⅤ結(jié)構(gòu)域均能抑制新生血管［5］。利用釀酒酵母重組表達(dá)的kringleⅤ結(jié)構(gòu)域，可以通過抑制新生血管實(shí)現(xiàn)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響［6］。本研究選用畢赤酵母重組表達(dá)Apo(a)羧基末端kringleⅤ結(jié)構(gòu)域(RHAKA)與kringleⅣ10型-kringleⅤ結(jié)構(gòu)域(RHAKB)，并驗(yàn)證其對新生血管的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酵母菌株:畢赤酵母X-33，甲醇利用型Mut+(Invitrogen公司)。細(xì)胞系:HUVEC:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells)Cascade;HCT 116:人結(jié)腸癌細(xì)胞，(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供)。雞胚:5日齡，三黃雞金星102品種;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所養(yǎng)雞場孵化室。畢赤酵母X-33分別使用甘油復(fù)合物緩沖培養(yǎng)基(BMGY，Invitrogen公司)與甲醇復(fù)合物緩沖培養(yǎng)基(BMMY，Invitrogen公司)進(jìn)行畢赤酵母的早期擴(kuò)增與后期甲醇誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)。HUVEC體外培養(yǎng)選用Medium 200 PRF培養(yǎng)基(Cascade)，37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱。HCT 116體外培養(yǎng)選用高糖DMEM(HyClone)含10%新生牛血清(PAA)培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱。

重組質(zhì)粒構(gòu)建:pPICZαA(Invitrogen公司)、Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa)、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(MBI)、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)。其他主要試劑盒:His·Bind Kits(Novagen)、BCATM蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce公司)、反相-高效液相色譜(RPHPLC)Waters 600E System Controller(Waters)、μBondapakTMC18 3.9 mm 300 mm層析柱(Waters)、巰基定量分析試劑盒(Molecular Probes)、CellTiter 96? AQueous One Solution細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒(Promega公司)。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

以人Apo(a)基因cDNA(NM_005577)為模板利用Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。分別設(shè)計用于擴(kuò)增RHAKA與RHAKB的引物(表1)，上游引物加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加入XbaⅠ酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后及EcoRⅠ與XbaⅠ的雙酶切后，克隆入pPICZαA以構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序確認(rèn)后，被線性化并轉(zhuǎn)染到畢赤酵母X-33(Invitrogen公司)。

1.3 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化與鑒定

畢赤酵母X-33經(jīng)過擴(kuò)增與甲醇誘導(dǎo)后分泌表達(dá)重組蛋白質(zhì)。利用硫酸銨沉淀法濃縮收集畢赤酵母培養(yǎng)基中的RHAKs。沉淀物溶于少量1×結(jié)合緩沖液，并用1×結(jié)合緩沖液透析多次以去除殘余的硫酸銨。進(jìn)而利用His·Bind Resin柱通過His·Tag親和層析純化重組蛋白質(zhì)。純化后的蛋白質(zhì)利用BCA? 蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行定量分析。

表1 RHAKs擴(kuò)增引物與PCR條件Table 1 PCR primers and conditions of RHAKs

重組蛋白質(zhì)樣品溶于0.1%三氟乙酸，利用水-乙腈梯度在45 min內(nèi)進(jìn)行RP-HPLC，監(jiān)測215 nm處的紫外吸光度變化。分別利用還原型與非還原型SDS-PAGE［是否含有二巰基蘇糖醇(DTT)］比較二硫鍵形成情況對蛋白質(zhì)電泳的影響。利用巰基定量分析試劑盒檢測分析RHAKs中是否存在游離巰基。利用NetNGlyc 1.0數(shù)據(jù)庫與NetOGlyc 3.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析RHAKs中的糖基化位點(diǎn)。利用過碘酸-Schiff試劑(PAS)染色明確RHAKs的糖基化。

1.4 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

利用CellTiter 96? AQueous One Solution細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測HUVEC與HCT 116的增殖情況。將約5 000個內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞接種至96孔板的每個孔中，加入含有不同濃度RHAKs的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h后每孔加入20 μL CellTiter 96?AQueous One Solution試劑，孵育1～4 h后分別讀取490 nm與655 nm下的吸光度值。計算各孔的Adual(Adual=A490－A655)，進(jìn)而計算并比較各實(shí)驗(yàn)孔與對照孔的比值之間的差異。

1.5 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)

制備0.1、1和10 μg 3種劑量的RHAKs甲基纖維素藥片。雞胚孵育第6天將藥膜放置在CAM中央，繼續(xù)孵育48 h。如果某個可見有大血管穿過的區(qū)域出現(xiàn)了一個直徑大于或等于3 mm的無血管區(qū)，則該區(qū)域即被視為陽性結(jié)果。通過出現(xiàn)陽性反應(yīng)的CAM例數(shù)不同來反映RHAKs對新生血管的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RHAKs的表達(dá)與純化

RHAKA與RHAKB分別包含123個氨基酸殘基與223個氨基酸殘基，其中都包含一個c-myc表位與一個His·Tag。用His·Tag親和層析后，RPHPLC證實(shí) RHAKs的純度達(dá) 90%以上(圖1)。RHAKs分泌表達(dá)后，其分泌信號肽因子被剪切，其中RHAKB氨基末端的6個氨基酸殘基依次為:谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蘇氨酸與谷氨酸，這與其氨基末端測序結(jié)果一致。相同的培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)表達(dá)時間下，RHAKA產(chǎn)量約為15 mg/L，RHAKB產(chǎn)量約為5 mg/L。

2.2 RHAKs的翻譯后修飾

SDS-PAGE結(jié)果提示RHAKs未形成多聚體結(jié)構(gòu)，而非還原型RHAKs較還原型具有更快的電泳遷移率(圖2)。RHAKA與RHAKB中不存在游離巰基，因此RHAKs的半胱氨酸均參與形成了分子內(nèi)二硫鍵。

經(jīng)過預(yù)測分析RHAKs中包含多個O-糖基化位點(diǎn)與N-糖基化位點(diǎn)(圖3A)。RHAKA與RHAKB均可被PAS試劑染色為淡紫紅色，由于RHAKB的糖基化位點(diǎn)多于RHAKA，故而其PAS試劑染色較深(圖3B)。

2.3 RHAKs對內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響

RHAKA與RHAKB均可抑制HUVECs的增殖，但對HCT 116的增殖卻無影響。RHAKs對HUVEC增殖的抑制效應(yīng)基本呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，在一些較高濃度作用下會出現(xiàn)顯著的抑制效應(yīng)，但RHAKA與RHAKB二者的抑制效應(yīng)之間沒有顯著差異(圖4)。

2.4 RHAKs抑制CAM的新生血管

RHAKA與RHAKB對CAM的血管生長具有明顯的抑制作用。隨著RHAKs的劑量增加，對CAM新生血管的抑制也越明顯。RHAKs各劑量組均與對照組存在顯著性差異(P＜0.05)。相同濃度下，RHAKA與RHAKB對CAM新生血管的抑制效應(yīng)無顯著性差異(圖5)。

3 討論

圖3 RHAKs的糖基化位點(diǎn)預(yù)測與PAS染色Fig 3 Glycosylation sites prediction and PAS staining of RHAKs

圖4 RHAKs對體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Influence of RHAKs on in vitro endothelial and carcinoma cell proliferation

圖5 RHAKs抑制CAM的新生血管Fig 5 RHAKs inhibited CAM angiogenesis

利用畢赤酵母分泌表達(dá)RHAKs可以近乎天然的形式高效大量地制備重組蛋白質(zhì)。本研究前期利用E.coli重組表達(dá)kringle結(jié)構(gòu)域，均以包涵體的形式表達(dá)。通過分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及翻譯后修飾特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，人Apo(a)中糖基數(shù)量約占其總分子質(zhì)量的28%，因此，糖基化的RHAKs分子質(zhì)量應(yīng)約為其氨基酸殘基分子質(zhì)量的1.39倍。選擇畢赤酵母作為表達(dá)宿主，其優(yōu)勢也主要在于可以分泌表達(dá)重組蛋白質(zhì)并完成其翻譯后的糖基化修飾。估算糖基化RHAKA的分子質(zhì)量約為19 ku，糖基化RHAKB的分子質(zhì)量約為35 ku，這也與其在還原型SDS-PAGE中的電泳遷移率吻合(圖2)。

血管生長是一個由多個步驟組成的連續(xù)變化的過程［7］。多數(shù)關(guān)于新生血管的調(diào)控研究都是針對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移展開的。研究證實(shí)，纖溶酶原中的kringle 1-4具有明顯的抑制新生血管的能力［2］，而其 kringle 5 抑制新生血管的能力更強(qiáng)［8］。人Apo(a)的kringleⅣ10型結(jié)構(gòu)域與kringleⅤ結(jié)構(gòu)域分別與纖溶酶原的kringle 4和kringle 5具有89%與91%同源性，因此也表現(xiàn)出了類似的抑制新生血管的能力。

本研究并未發(fā)現(xiàn)RHAKB較RHAKA具有更強(qiáng)的抑制新生血管的能力，說明kringleⅤ結(jié)構(gòu)域是Apo(a)中發(fā)揮抑制新生血管的關(guān)鍵因素。RHAKs對腫瘤細(xì)胞的體外增殖沒有直接的抑制效應(yīng)，因此其對體內(nèi)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的抑制效果主要是通過抑制新生血管而間接發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實(shí)畢赤酵母是一種高效表達(dá)重組kringle結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的合適宿主。重組表達(dá)人Apo(a)羧基末端kringleⅣ10型、kringleⅤ結(jié)構(gòu)域可以顯著抑制新生血管，其中kringleⅤ型結(jié)構(gòu)域更為關(guān)鍵。

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