濕地蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落時(shí)空分布及其與水質(zhì)因子的關(guān)系

熊 薇1，郭逍宇1，*，趙 霏1

(1.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院，北京100048;2.北京市城市環(huán)境過程與數(shù)字模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京100048;3.三維信息獲取與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048;4.資源環(huán)境與地理信息系統(tǒng)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048)

再生水作為一種穩(wěn)定的再生水源，在緩解北京市濕地水資源供需矛盾、減輕濕地水環(huán)境污染方面發(fā)揮了重要作用［1-3］，據(jù)統(tǒng)計(jì)到2010年北京市再生水利用6.8億m3，其中河湖環(huán)境利用2.1億m3，占再生水利用總量的30.9%［4］，但再生水中豐富的氮、磷含量決定了再生水利用必然會(huì)產(chǎn)生許多負(fù)面環(huán)境效應(yīng)，再加上城市濕地多為封閉性水體，水流速度較緩，水體更新周期較長(zhǎng)，水體生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為單一，使得水體富營(yíng)養(yǎng)化成為濕地再生水利用的最大障礙［5］。

城市人工濕地不僅具有重要的景觀作用，而且具有良好的環(huán)境污染修復(fù)能力，能有效去除水體氮、磷、各種有機(jī)物質(zhì)、重金屬氧化物，降低水體生化需氧量(BOD)、總懸浮固體(TSS)含量［6-7］，植物在人工濕地氮污染修復(fù)過程中扮演重要角色［8］，Oostrom等認(rèn)為濕地中13%的氮是通過基質(zhì)的過濾和植物吸收作用被去除的，濕地植物的凈化作用主要是通過植物群落根際分泌物及凋落物的分解影響微生物群落的功能，進(jìn)而影響系統(tǒng)的凈化效能［9］。Li等采用基因文庫技術(shù)對(duì)北京翠湖人工濕地蘆葦和香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行研究，結(jié)果表明濕地植物根內(nèi)生菌群落對(duì)濕地氮、磷、硫以及有機(jī)復(fù)合物具重要的降解作用，對(duì)濕地修復(fù)具重要意義［10-11］。Atif等運(yùn)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)研究了兩個(gè)典型垂直流人工濕地植物凋落物及沉積物中氮去除功能細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明功能細(xì)菌群落因基質(zhì)不同及采樣點(diǎn)位置不同而具有顯著差異，功能細(xì)菌群落多樣性與濕地凈化系統(tǒng)功能作用相關(guān)［12］。大量研究表明濕地植物根圍細(xì)菌多樣性與水體物理化學(xué)性質(zhì)、濕地凈化效率、人工濕地系統(tǒng)穩(wěn)定性具顯著相關(guān)性［5，13-14］，且具顯著的季節(jié)動(dòng)態(tài)特征［15-16］，但從環(huán)境因素角度揭示濕地微生物群落結(jié)構(gòu)差異機(jī)制的研究尚鮮見報(bào)道。

借助于生態(tài)學(xué)多樣性測(cè)度方法研究復(fù)雜多樣的微生物群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)較為成熟［17-19］，而濕地微生物多樣性信息主要依靠培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法如基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性性分析(ARDRA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)技術(shù)獲得。盡管傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法對(duì)于研究微生物群落結(jié)構(gòu)有不足之處，但培養(yǎng)法不僅對(duì)微生物資源的開發(fā)與利用具重要作用，而且可通過培養(yǎng)基的選擇作用有針對(duì)性的反映人工濕地中具有不同分解作用的細(xì)菌類群，如在普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌可能代表了對(duì)含氮有機(jī)污染物具有較強(qiáng)分解能力的微生物類群，而有機(jī)氮素如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和尿素等是富營(yíng)養(yǎng)水體的主要污染元素，這一類群的細(xì)菌可能在氮污染水體的治理上具有重要的應(yīng)用潛力［20］，對(duì)研究再生水補(bǔ)水濕地微生物凈化機(jī)理具有重要作用?；诖吮狙芯恳员本W林匹克公園再生水人工濕地凈化系統(tǒng)為例，借助細(xì)菌培養(yǎng)與ARDRA相結(jié)合的技術(shù)分析研究夏秋兩季的凈化系統(tǒng)不同功能區(qū)濕地蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，并借助典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)研究水質(zhì)變量對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征變異的主要水質(zhì)參數(shù)［21］，為再生水城市濕地利用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

奧林匹克公園人工濕地凈化系統(tǒng)地處北京市北部，位于奧林匹克公園園內(nèi)，于2007年開始運(yùn)行。該區(qū)屬暖溫帶半干旱半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候。多年平均氣溫11—12℃，極端最高氣溫41.6℃，極端最低氣溫-21.2℃。多年平均水面蒸發(fā)量在1200 mm左右，多年平均降雨量約600 mm。降雨年內(nèi)分配不均，多集中在汛期6—9月，約占全年的85%。該凈化系統(tǒng)以兩個(gè)復(fù)合垂直流人工濕地為核心，以氧化塘為補(bǔ)充，形成多層次的凈化系統(tǒng)，將來自清河再生水廠的再生水凈化處理后作為奧林匹克公園主湖補(bǔ)充水源。其中，復(fù)合垂直流人工濕地由垂直向下流和垂直向上流兩部分濕地構(gòu)成。濕地系統(tǒng)內(nèi)水生植物主要包括蘆葦、香蒲、水蔥、千屈菜等，植被覆蓋度較高，可達(dá)70%—90%。凈化系統(tǒng)各處理區(qū)分布及水流方向如圖1［22］。再生水作為補(bǔ)充水源首先進(jìn)入復(fù)合垂直流人工濕地再生水處理區(qū)(RW)，同時(shí)主湖水循環(huán)至復(fù)合垂直流人工濕地循環(huán)水處理區(qū)(CW)，再生水處理出水經(jīng)氧化塘區(qū)(OP)深化處理后進(jìn)入主湖，主湖水停留后會(huì)進(jìn)行下一次循環(huán)。

圖1 北京奧林匹克公園再生水人工濕地凈化系統(tǒng)示意圖Fig．1 Location and distribution of the purification system in Beijing Olympic Park

2 材料與方法

2.1 蘆葦根系樣品采集及水質(zhì)測(cè)定

選取研究區(qū)不同處理區(qū)典型濕地植物蘆葦為研究對(duì)象，于2010年11月9日、2011年6月11日在人工濕地凈化系統(tǒng)中RW、CW、OP功能區(qū)分別獲得蘆葦根系樣品，新鮮表面附著基質(zhì)的蘆葦根系樣品置于無菌三角瓶中密封，立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理分析。并對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)，夏季編號(hào)為SRW、SCW、SOP，秋季各功能區(qū)樣品編號(hào)為ARW、ACW、AOP。于夏、秋兩季分別在3個(gè)功能區(qū)均勻布3個(gè)樣點(diǎn)，采集水樣，分析與氮污染相關(guān)的水體富營(yíng)養(yǎng)化指標(biāo)。水質(zhì)樣品低溫儲(chǔ)藏帶回實(shí)驗(yàn)室處理。其中，水體化學(xué)需氧量(COD)、總磷(TP)采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定，NH+4、NO-3濃度由離子色譜儀(ICS-1500型、ICS-90型，美國(guó)Dionex)測(cè)定，水體總氮(TN)采用耶拿Multi N/CUV分析儀測(cè)定。其余水質(zhì)參數(shù)，包括葉綠素a(CHL)、溶解氧(DO)、氯離子(Cl-)、藍(lán)綠藻(PCY)、鹽度(Sal)、總?cè)芙庑怨腆w(TDS)、電導(dǎo)系數(shù)(SPC)、氧化還原電位(ORP)由水質(zhì)儀(Hydrolab Datasonde5 5 X，the United States)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 夏秋兩季水質(zhì)理化性質(zhì)Table 1 Water quality of constructed wetland in autumn and summer

2.2 根結(jié)合菌細(xì)菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、分離純化

將新鮮表面附著基質(zhì)的蘆葦根系置于震蕩儀震蕩去除表面附著物，取表面清洗干凈的蘆葦根系1 g，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸取多余水分，置于滅菌研缽內(nèi)，加入少量無菌石英砂及少量無菌水研磨后定容100 mL。此液體依次稀釋涂板，采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，每梯度3個(gè)平行，在30℃條件下倒置培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)目，計(jì)算可培養(yǎng)細(xì)菌的平均數(shù)目。選擇菌落數(shù)在30—300范圍的稀釋度平板，將所有單菌落分別轉(zhuǎn)接劃線LB培養(yǎng)基平板上，分離純化。

2.3 擴(kuò)增16SrDNA限制性分析

2.3.1 PCR模板制備

用無菌牙簽挑取少量已純化的菌體重懸于20μL無菌ddH2O中，置于沸水浴中煮沸10 min，立即置于冰上5 min，4℃，10000 rpm離心5 min，置于冰上，使用時(shí)取2.0μL上清液做模板［23-24］。

2.3.2 16SrDNA擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物765f:5'-GGAGCAAACAGGATTTGATA-3'，和1492r:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'［25］對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。25μL擴(kuò)增體系包含:12.5μL 2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司，KT201-12)，1μL 10μmol/L引物765f和1μL 10μmol/L 1492r(生工生物工程(上海)有限公司)，2μL DNA模板，8.5μL無菌水。PCR反應(yīng)程序94℃，5 min;30個(gè)循環(huán)包括94℃，30 s，55℃，1 min，72℃，1 min;72℃ 延伸10 min;4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2.3.3 擴(kuò)增片段酶切分型

用限制性內(nèi)切酶Hae III對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，10μL酶切體系:5μL PCR產(chǎn)物，0.3μL Hae III(10 U/μL)，1 μL 10×buffer，3.7μL雙蒸水。37℃反應(yīng)4 h。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE電泳緩沖液，100 V電泳60 min。比較分析酶切電泳圖譜。

2.4 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析

據(jù)酶切圖譜信息，將酶切圖譜完全一致的菌落劃分為1個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)［26］，據(jù)此估計(jì)樣品中存在的最低限度的細(xì)菌數(shù)目，并運(yùn)用SPSS18.0將菌落聚類。依此分類分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析。利用Shannon-Weaver指數(shù)(H')評(píng)價(jià)細(xì)菌群落綜合多樣性，以EI計(jì)算均勻度指數(shù)，以Margale指數(shù)(D')評(píng)價(jià)群落豐富度。CCA排序圖由Canoco for Windows 4.5和TWINSPAN軟件包共同完成，其余圖表由Microsoft Excel 2007完成。多樣性評(píng)價(jià)指數(shù)計(jì)算公式如下:

式中，Pi=ni/N，S是圖譜的分類數(shù)，ni是第i類包含的圖譜，N為總圖譜數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌群落密度分析

人工濕地微生物群落密度與污水凈化效率具有密切關(guān)系，微生物數(shù)量與污染物去除率呈正相關(guān)［14，20，27］。群落密度分析結(jié)果見表2，從季節(jié)變異看，夏季蘆葦根結(jié)合微生物群落密度較秋季增加76.37%—96.70%，具有明顯的季節(jié)效應(yīng)。從濕地類型差異來看，再生水和循環(huán)水經(jīng)復(fù)合垂直流人工濕地處理進(jìn)入氧化塘后，微生物群落密度減少。從補(bǔ)水水質(zhì)差異看，再生水處理區(qū)微生物群落密度高于循環(huán)水處理區(qū)，夏秋兩季在不同功能區(qū)表現(xiàn)出相同的分布格局。為進(jìn)一步分析環(huán)境因子對(duì)蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落密度的影響，采用spearman秩相關(guān)系數(shù)分析(表4)水環(huán)境因子對(duì)群落密度的影響，結(jié)果顯示凈化系統(tǒng)水體濃度(0.934＊＊，P﹤0.001)和ORP(0.886*，P﹤0.005)與群落密度顯著相關(guān)，是影響細(xì)菌密度時(shí)空差異的主要因素。

表2 蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落密度Table 2 Community density of the different water treatment units

3.2 蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空變異分析

通過聚類分析，將獲得138株分離物劃分為29個(gè)OTUs，每個(gè)OTUs至少代表一種細(xì)菌，表明研究區(qū)至少分布29種不同細(xì)菌(圖2)。其中，16個(gè)OTUs屬于夏季，14個(gè)OTUs屬于秋季，OTU28是夏秋兩季唯一的共有OTU，該類群從夏季優(yōu)勢(shì)類群過渡為秋季偶見類群。夏季16個(gè)OTUs中，11個(gè)OTUs屬于再生水處理區(qū)，8個(gè)OTUs屬于循環(huán)水處理區(qū)，4個(gè)OTUs屬于氧化塘，其中OTU1，OTU28是夏季3個(gè)功能區(qū)共有類群，OTU1從再生水處理區(qū)和循環(huán)水處理區(qū)的優(yōu)勢(shì)類群過渡為氧化塘的非優(yōu)勢(shì)類群，OTU28從再生水區(qū)和氧化塘的優(yōu)勢(shì)類群過渡為循環(huán)水區(qū)的偶見類群。11個(gè)OTUs屬于各功能區(qū)特有OTU，特有OTU均為非優(yōu)勢(shì)類群或偶見類群，其中8個(gè)OTUs屬于再生水處理區(qū)，3個(gè)OTUs屬于循環(huán)水處理區(qū)。秋季14個(gè)OTUs中，6個(gè)OTUs屬于再生水處理區(qū)，5個(gè)OTUs屬于循環(huán)水處理區(qū)，10個(gè)OTUs屬于氧化塘，其中，OTU12，OTU18是秋季3個(gè)功能區(qū)的共有類群，OTU12從再生水處理區(qū)和循環(huán)水處理區(qū)的偶見類群過渡為氧化塘的非優(yōu)勢(shì)類群，OTU18是秋季3個(gè)功能區(qū)的共有優(yōu)勢(shì)類群。9個(gè)OTUs屬于各功能區(qū)特有OTU，特有OTU均為非優(yōu)勢(shì)類群或偶見類群，其中2個(gè)OTUs屬于再生水處理區(qū)，2個(gè)OTUs屬于循環(huán)水處理區(qū)，5個(gè)OTUs屬于氧化塘?？梢娂竟?jié)動(dòng)態(tài)對(duì)微生物種群類型分布的響應(yīng)體現(xiàn)在夏秋兩季微生物豐富度差別不大，但夏季群落均勻性高于秋季，及共優(yōu)種比例增高，優(yōu)勢(shì)種群類型改變。

圖2 不同OTUs分離菌株在總分離菌株中的分布Fig．2 Bacterial number distribution of OTUs in all bacterial number

根據(jù)單個(gè)OTUs包含菌株與該樣品中總菌株數(shù)的比例，對(duì)菌株情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表3)。季節(jié)動(dòng)態(tài)對(duì)蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響主要體現(xiàn)在:其一，夏季較秋季優(yōu)勢(shì)類群、非優(yōu)勢(shì)類群及偶見類群3大類群的OTU類型多樣化;其二，夏季較秋季偶見類群數(shù)量百分比呈下降趨勢(shì)。蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間差異夏季體現(xiàn)為:其一，復(fù)合垂直流人工濕地(再生水處理區(qū)、循環(huán)水處理區(qū))較氧化塘非優(yōu)勢(shì)類群和偶見類群類型多樣化;其二，復(fù)合垂直流人工濕地(再生水處理區(qū)、循環(huán)水處理區(qū))較氧化塘非優(yōu)勢(shì)類群及偶見類群數(shù)量百分比增加，其三，不同功能區(qū)之間優(yōu)勢(shì)類群差異增大，再生水處理區(qū)為OTU1和OTU28，循環(huán)水處理區(qū)為OTU1，氧化塘為OTU7和OTU28。三者共同作用導(dǎo)致復(fù)合垂直流人工濕地豐富度及均勻度均增高。蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間差異秋季體現(xiàn)為:其一，氧化塘較復(fù)合垂直流人工濕地豐富度增高，均勻度變化規(guī)律不明顯;其二，不同功能區(qū)之間優(yōu)勢(shì)類群趨于一致，均為OTU18。綜合不同OTUs分離菌株在總分離菌株中的分布及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，多樣化的類型及其較低頻次的偶見類群共同作用使得夏季較秋季微生物群落結(jié)構(gòu)的豐富度及均勻度均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。共有的優(yōu)勢(shì)類群多度降低，特有的偶見類群增加，同時(shí)偶見類群的多度減少。偶見種類群增加主要體現(xiàn)在特有種類群增多。

表3 凈化系統(tǒng)可培養(yǎng)蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空差異Table 3 Spatial variability of bacterial community structure in reclaimed water management system

為解釋水質(zhì)變量對(duì)群落結(jié)構(gòu)分布格局的影響，采用Spearman秩相關(guān)分析群落組成類群的數(shù)量百分比與主要水質(zhì)指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果如表4，優(yōu)勢(shì)類群所占百分比與PCY濃度相關(guān)(r=0.771*，P＜0.05)，偶見類群所占百分比與ORP(r=0.771*，P＜0.05)、TP(r=0.771*，P＜0.01)、TN(r=0.771*，P＜0.05)、NH+4(r=0.829*，P＜0.05)相關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果表明細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群是水質(zhì)凈化的主要貢獻(xiàn)者，優(yōu)勢(shì)類群對(duì)消除水體富營(yíng)養(yǎng)化起重要作用，與水體富營(yíng)養(yǎng)化緊密相關(guān)。在一定條件下，細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)類群百分比隨水體PCY濃度增高而增加。細(xì)菌偶見類群一般因環(huán)境擾動(dòng)導(dǎo)致新物種的產(chǎn)生或者已存物種的消亡而出現(xiàn)，濕地水體營(yíng)養(yǎng)水平及氧化還原環(huán)境的改變是偶見類群出現(xiàn)的擾動(dòng)因素，其改變導(dǎo)致新的適應(yīng)性類群出現(xiàn)及非偶見類群數(shù)量減少，與偶見類群緊密相關(guān)。

表4 水質(zhì)指標(biāo)與蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落特征的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of Water quality and bacterial community characteristics

3.3 蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落多樣性分析

采用多樣性指數(shù)進(jìn)一步分析蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落的時(shí)空變異，分析結(jié)果見表5。其中，Shannon-Weaver指數(shù)受群落物種豐富度影響較大，Margale指數(shù)反映群落物種豐富度，均勻度指數(shù)反應(yīng)群落物種均勻性大小。從表中可以看出，夏季較秋季復(fù)合垂直流人工濕地好氣蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落Shannon-Weaver指數(shù)、豐富度指數(shù)顯著增高，均勻度指數(shù)變化不大，氧化塘區(qū)好氣細(xì)菌群落均勻度指數(shù)增加，Shannon-Weaver指數(shù)及Margale指數(shù)均減少，復(fù)合垂直流人工濕地與氧化塘細(xì)菌多樣性具不同的季節(jié)差異。夏季再生水凈化系統(tǒng)中，再生水處理區(qū)具最高Shannon-Weaver指數(shù)、Margale指數(shù)，氧化塘區(qū)Shannon-Weaver指數(shù)、Margale指數(shù)處于最低水平，但是在秋季再生水凈化系統(tǒng)中氧化塘區(qū)具最高Shannon-Weaver指數(shù)、Margale指數(shù)，循環(huán)水區(qū)Shannon-Weaver指數(shù)、Margale指數(shù)具最低水平?？偟膩砜?，氧化塘細(xì)菌群落多樣性受季節(jié)動(dòng)態(tài)影響最小，而復(fù)合垂直流人工濕地細(xì)菌群落多樣性季節(jié)變異較大。再生水處理區(qū)較循環(huán)水處理區(qū)夏秋兩季細(xì)菌群落多樣，豐富度及均勻性均增高。

表5 秋夏兩季可培養(yǎng)蘆葦根結(jié)合細(xì)菌多樣性分析Table 5 Diversity of bacterial community of three water treatment units and two seasons

3.4 CCA排序分析

為進(jìn)一步分析再生水濕地凈化系統(tǒng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)參數(shù)響應(yīng)關(guān)系，結(jié)合運(yùn)用典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)排序法和雙向指示種分類法(TWINSPAN)，分析夏秋兩季細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及其成因。以6樣方內(nèi)29個(gè)OTUs在群落中權(quán)重組成的物種矩陣和12種環(huán)境參數(shù)組成的環(huán)境變量矩陣為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，應(yīng)用CCA排序，得到樣方、物種、環(huán)境因子相互關(guān)系的二維排序圖，并應(yīng)用TWINSPAN將29個(gè)OTUs分為7類(圖3)。排序結(jié)果表明，CCA排序圖第一軸AX1和第二軸AX2的特征值累計(jì)占總特征值的65.06%，排序圖包含了大部分的信息，排序效果良好。在CCA排序圖中，物種用三角形符號(hào)表示，物種之間夾角余弦值越大表示它們?cè)较嚓P(guān)。樣方點(diǎn)用圓圈表示，樣方之間的距離越近則表示樣方間越相似。各環(huán)境因子用箭頭表示，箭頭的長(zhǎng)短表示某個(gè)環(huán)境因子與種群分布相關(guān)性的大小，線越長(zhǎng)，說明相關(guān)性越大，反之則小。從圖5箭頭的連線長(zhǎng)度可以看出，選取的12個(gè)與氮污染相關(guān)的水環(huán)境變量對(duì)蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間分布狀況都有一定程度的影響，其中，TDS、pH值、DO、Sal、TP、ORP對(duì)好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)時(shí)空分布影響較大，TN較NH+4、NO-3對(duì)群落結(jié)構(gòu)時(shí)空變異貢獻(xiàn)率高。箭頭方向表示環(huán)境變量之間或者環(huán)境變量與排序軸的之間的關(guān)系，夾角越小，相關(guān)性越大［16］，其中NH+4、TN、ORP、TP與第1軸關(guān)系密切，NO-3、TDS、pH值、Sal與第2軸密切相關(guān)。

圖3 29 OTUs的CCA雙軸排序圖，其中a為夏秋兩季物種與環(huán)境因子的CCA排序圖，b是對(duì)a圖中第4類的放大，是秋季特有物種與水質(zhì)的CCA排序圖Fig．3 Bi-plot(species and environmental variables)of CCA for summer and autumn survey on bacterial diversity in reclaimed water purification system(a)，Bi-plot(species and environmental variables)of CCA for autumn survey on diversity of unique bacteria，which is the additional information of(b)

依據(jù)TWINSPAN對(duì)物種分類結(jié)果，將圖3中29 OTUs圈為4類，其中夏季分為三類，分別是:如圖第1類，包含Ⅳ(SRW)樣方的偶見類群及部分非優(yōu)勢(shì)類群;第2類，包含Ⅳ、Ⅴ(SRW、SCW)樣方共有種群，且為優(yōu)勢(shì)種或非優(yōu)勢(shì)種;第3類，包含Ⅴ、Ⅵ(SCW、SOP)樣方的共有種及Ⅴ樣方的獨(dú)有種，秋季分為一類，即第4類，第4類包括秋季特有類群。圖3中第2類臨近排序中心，在凈化系統(tǒng)中具相對(duì)穩(wěn)定豐度，這些類群對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，生態(tài)幅比較廣泛，在濕地物質(zhì)和能量代謝中發(fā)揮重要作用，如，OTU28(B)在夏季3個(gè)功能區(qū)均出現(xiàn)，為夏季再生水處理區(qū)優(yōu)勢(shì)種，是水質(zhì)凈化的重要類群，第1類遠(yuǎn)離排序中心，均為夏季再生水處理區(qū)獨(dú)有種，易受環(huán)境因子影響，較少頻率出現(xiàn)于再生水凈化系統(tǒng)中，對(duì)水體凈化不起主要作用。夏季種群沿第2軸分散分布于第1軸的負(fù)半軸，而秋季種群集中分布于第1軸的正半軸，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具顯著季節(jié)差異。從圖3還可以看出，、TN、ORP、TP是導(dǎo)致凈化系統(tǒng)可培養(yǎng)細(xì)菌群落季節(jié)演替的主要水質(zhì)變量，、TDS、pH、Sal是導(dǎo)致夏季可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間演替的主要因素。第2類，包括優(yōu)勢(shì)類群OTU1(a)OTU28(B)與PCY和CHL密切相關(guān)，對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化去除其主要作用類群。第3類，包括樣方SOP優(yōu)勢(shì)類群OTU7(g)及樣方SCW偶見類群OTU3(c)、OTU10(j)、OTU11(k)、OTU16(p)與DO具有密切的關(guān)系，DO是改善濕地氧化還原環(huán)境的重要環(huán)境因子，氧化塘與復(fù)合垂直流濕地基質(zhì)中具不同氧氣分布特征，導(dǎo)致各區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。第1類與測(cè)定的水體富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境因子不具顯著關(guān)系，說明再生水特有的性質(zhì)影響了該區(qū)根結(jié)合細(xì)菌群落的偶見類群的分布格局，需要進(jìn)一步結(jié)合細(xì)菌測(cè)序結(jié)果分析。從圖3可以看出，秋季各樣點(diǎn)及蘆葦根結(jié)合可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)梯度排序是各水質(zhì)變量共同作用的結(jié)果，這與秋季各處理區(qū)凈化效率降低，各功能區(qū)優(yōu)勢(shì)類群趨于一致有緊密聯(lián)系。結(jié)合分類結(jié)果可以看出，第2類和第4類類群具相對(duì)較高豐度，受環(huán)境因子影響較小，如，O(r)是秋季凈化系統(tǒng)3個(gè)功能區(qū)共有優(yōu)勢(shì)種，OTU12(l)在秋季凈化系統(tǒng)3個(gè)功能區(qū)中均有出現(xiàn)，但其與水體富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境因子不具密切關(guān)系，這說明秋季優(yōu)勢(shì)類群的水質(zhì)凈化作用較小。第1類較偏好高TN、TP濃度，第3類較偏好高DO、NH+4、Sal濃度，這兩類與水體富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境因子密切相關(guān)，但這些類群不占優(yōu)勢(shì)。

4 討論與結(jié)論

大量研究表明微生物在人工濕地中起核心作用，研究濕地微生物多樣性的技術(shù)方法很多，而培養(yǎng)法只記錄適合在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物群落，該法只能反映自然環(huán)境少部分的微生物，不能全面反映濕地中細(xì)菌群落的真實(shí)情況。但是，培養(yǎng)法的優(yōu)勢(shì)在于利用不同的培養(yǎng)基，可以選擇性的反映濕地中對(duì)不同資源具較強(qiáng)利用能力的微生物群落［20］。如本研究中利用LB培養(yǎng)基分離的細(xì)菌可以反映對(duì)再生水中氮素如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、尿素等及有機(jī)碳具較強(qiáng)分解能力的細(xì)菌類群［28-29］，是修復(fù)水體富營(yíng)養(yǎng)化的優(yōu)勢(shì)類群，分析其時(shí)空變異規(guī)律及其與水富營(yíng)養(yǎng)化因子的關(guān)系，對(duì)于再生水補(bǔ)水濕地水生態(tài)修復(fù)機(jī)制具有重要的意義。

4.1 凈化系統(tǒng)可培養(yǎng)蘆葦根結(jié)合細(xì)菌群落特征及多樣性時(shí)空差異

微生物與環(huán)境因子之間有密切的響應(yīng)關(guān)系，許多研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)特征是微生物群落與環(huán)境因子長(zhǎng)期響應(yīng)的結(jié)果，受植物生長(zhǎng)狀況和代謝活動(dòng)、氣候季節(jié)變化、污水處理工藝、污水水體水質(zhì)狀況等多種因素影響，基于多因子共同作用微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性呈現(xiàn)差異［28，30］。

(1)凈化系統(tǒng)蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落密度、群落組成特征、群落多樣性均表現(xiàn)出顯著的季節(jié)差異。夏季較秋季凈化系統(tǒng)蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落密度增加，這與夏季較秋季凈化系統(tǒng)細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)類群百分比增大，非優(yōu)勢(shì)類群及偶見類群百分比減少相關(guān)。夏季較秋季復(fù)合垂直流人工濕地細(xì)菌群落多樣性、豐富度、均勻度一致呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，這與夏季較秋季該類型人工濕地細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)類群、非優(yōu)勢(shì)類群和偶見類群種類數(shù)均增加密切相關(guān)。Florent Chazarenc等采用Biolog Ecoplate的方法對(duì)人工濕地微生物群落時(shí)空差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明季節(jié)動(dòng)態(tài)是影響微生物群落多樣性最主要因素之一［15］。高程等對(duì)北京城區(qū)不同水體可培養(yǎng)細(xì)菌的研究表明夏季細(xì)菌數(shù)量高于秋季［20］。王曉丹等同時(shí)采用用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)密云水庫細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明季節(jié)差異導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［28］。陸開宏等通過對(duì)富營(yíng)養(yǎng)水體植物根際微生物群落特征分析發(fā)現(xiàn)因季節(jié)差異，植物的生長(zhǎng)狀況及代謝改變，植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，并影響水體污染物的去除效率［30］。由前人研究可知，在濕地生態(tài)系統(tǒng)或水體生態(tài)系統(tǒng)中，采用培養(yǎng)法或非培養(yǎng)法，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果均表明細(xì)菌群落受季節(jié)影響，具明顯的季節(jié)效應(yīng)。在再生水濕地凈化系統(tǒng)中，夏季向秋季的季節(jié)轉(zhuǎn)變不僅降低了凈化系統(tǒng)細(xì)菌生長(zhǎng)溫度，影響了細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及活性，而且導(dǎo)致濕地蘆葦枯萎凋零，植物功能減弱，根系分泌物質(zhì)能力、泌氧功能降低，植物-微生物的互作去污作用降低，依托于植物、微生物、基質(zhì)共同作用凈化水質(zhì)的人工濕地生態(tài)功能受到影響，水質(zhì)凈化效率降低，進(jìn)一步促使水體有機(jī)負(fù)荷及污染物的積累，水質(zhì)惡化，細(xì)菌密度及多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異［31-32］。

(2)凈化系統(tǒng)蘆葦根結(jié)合可培養(yǎng)細(xì)菌群落密度、細(xì)菌群落構(gòu)成特征、群落多樣性均表現(xiàn)出顯著的空間差異。夏季各處理區(qū)群落結(jié)構(gòu)差異明顯高于秋季，夏季凈化系統(tǒng)空間差異具體表現(xiàn)為復(fù)合垂直流濕地較氧化塘好氣細(xì)菌群落密度、多樣性、豐富度增加，均勻度減少，這與復(fù)合垂直流濕地非優(yōu)勢(shì)類群和偶見類群類型、數(shù)量百分比增加相關(guān);再生水處理區(qū)較循環(huán)水處理區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌群落密度、多樣性、豐富度、均勻度增加，這與再生水凈化區(qū)優(yōu)勢(shì)類群、非優(yōu)勢(shì)類群類型增加，非優(yōu)勢(shì)類群數(shù)量百分比增加，偶見類群量百分比減少相關(guān)。秋季凈化系統(tǒng)空間分布特征具體表現(xiàn)為:3個(gè)不同功能區(qū)具有相同優(yōu)勢(shì)類群，但3個(gè)功能區(qū)優(yōu)勢(shì)類群百分比呈現(xiàn)顯著差異，而偶見類群百分比在3各功能區(qū)具有趨同效應(yīng);復(fù)合垂直流濕地較氧化塘細(xì)菌群落多樣性及豐富度均減少，均勻度變化規(guī)律不明顯，這與復(fù)合垂直流濕地非優(yōu)勢(shì)類群、偶見類群類型減少相關(guān);再生水處理區(qū)較循環(huán)水處理區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌群落密度、多樣性、豐富度、均勻度增加，這與再生水處理區(qū)非優(yōu)勢(shì)類群類型數(shù)、百分比數(shù)均增加相關(guān)，夏秋兩季分析結(jié)果一致表明再生水處理區(qū)具最高的群落密度和細(xì)菌群落多樣性。前人研究表明濕地微生物數(shù)量與其凈化功能之間存在顯著關(guān)系，微生物數(shù)量越多污染物的去除效率越高［27］。魏成等研究表明提高濕地系統(tǒng)的多樣性對(duì)提高濕地系統(tǒng)的凈化效率和效率的穩(wěn)定性具重要意義［14］。濕地工藝流程與其凈化功能之間同樣存在顯著關(guān)系，復(fù)合垂直流人工濕地特殊結(jié)構(gòu)及進(jìn)水類型有利于水體營(yíng)養(yǎng)及溶解氧分布、好養(yǎng)-厭氧-好養(yǎng)功能層形成，有利于微生物生長(zhǎng)繁殖及活性，促進(jìn)復(fù)雜有機(jī)物、氮、磷去除，提高污水凈化效率［33］。其次，進(jìn)水水質(zhì)的差異是影響微生物及其凈化功能的主要因素，再生水中豐富的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素利于微生物數(shù)量增加，并改變微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性［23］。本研究中，復(fù)合垂直流濕地先進(jìn)工藝特征及再生水特殊水質(zhì)是影響再生水補(bǔ)水濕地系統(tǒng)中不同處理區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

4.2 凈化系統(tǒng)蘆葦根結(jié)合可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與水環(huán)境的相互關(guān)系

據(jù)文獻(xiàn)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)之間的關(guān)系還沒有明確定論，研究方法也多采用相關(guān)性分析法。已有相關(guān)研究表明水質(zhì)狀況對(duì)微生物群落產(chǎn)生重要影響的同時(shí)微生物適應(yīng)環(huán)境并改變水體環(huán)境，微生物群落多樣性呈現(xiàn)出與水環(huán)境質(zhì)量協(xié)同變化的特征［34］。梁威等的研究發(fā)現(xiàn)濕地微生物活動(dòng)是污水中TN及COD的主要去除途徑［27］，其隨后研究表明污水中BOD的去除率與復(fù)合垂直流濕地細(xì)菌總數(shù)顯著相關(guān)［35］。CCA和TWINSPAN是兩種具有很強(qiáng)解釋能力的多元統(tǒng)計(jì)方法，它們生態(tài)學(xué)中成功運(yùn)用，已被認(rèn)為是最有效的群落定量分析方法［36］。近年來有學(xué)者嘗試將CCA排序和多元回歸結(jié)合，這為分析微生物群落物種對(duì)水質(zhì)變量的聯(lián)合反應(yīng)提供了通用框架。YAN等采用CCA分析了污水處理廠微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)演替，結(jié)果表明COD、、KN、C/N/P值是重要的微生物生長(zhǎng)限制因子，DO是微生物群落演替的關(guān)鍵因子［16］。Shiah＆Ducklow通過對(duì)細(xì)菌群落構(gòu)成的控制研究揭示出溫度是冬季、秋季、春季的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的控制因子，而無機(jī)營(yíng)養(yǎng)限制及基質(zhì)是夏季細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的控制因子［37］。另一些研究，包括一個(gè)中型實(shí)驗(yàn)，也支持同樣的觀點(diǎn)，認(rèn)為有機(jī)碳、無機(jī)營(yíng)養(yǎng)是夏季細(xì)菌群落的重要限制因子［38-39］。微生物的呼吸作用和發(fā)酵過程是有機(jī)污染物的重要去除機(jī)制，其去除過程依賴于濕地氧化還原條件，高ORP為微生物提供氧化環(huán)境，有利于好養(yǎng)過程，如硝化作用、有機(jī)碳的降解，相反，低ORP提供還原環(huán)境，有利于厭氧過程，如硫酸鹽降解、甲烷化。

本研究分析結(jié)果表明凈化系統(tǒng)蘆葦根結(jié)合好氣細(xì)菌群落密度與水體濃度及ORP相關(guān)，群落構(gòu)成與水體PCY、TP、TN和濃度及ORP相關(guān)，ORP是DO、有機(jī)物和含氮污染物三者氧化還原性的綜合體現(xiàn)，寬泛的ORP范圍有利于多種污染物的去除［8］，是好養(yǎng)微生物通過氨化作用對(duì)水體有機(jī)氮降解的產(chǎn)物。夏季凈化系統(tǒng)較秋季因具較高的細(xì)菌群落密度，群落多樣性，凈化效率提高，對(duì)有機(jī)物的去除效率提高，雖然夏季較秋季水體具較高的DO濃度，但較秋季ORP依然處于較低水平，這也是ORP與可培養(yǎng)細(xì)菌群落密度負(fù)相關(guān)的原因，較高的DO濃度有利于細(xì)菌的氨化作用，這是夏季較秋季水體具低水平COD、TDS及TN，同時(shí)與好氣細(xì)菌群落密度正相關(guān)的原因。PCY濃度是水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要水質(zhì)指標(biāo)，其生長(zhǎng)繁殖需要充足的營(yíng)養(yǎng)和優(yōu)越的物理?xiàng)l件［40］，PCY濃度與優(yōu)勢(shì)種百分比相關(guān)，說明優(yōu)勢(shì)種對(duì)消除水體富營(yíng)養(yǎng)化，對(duì)去除氮污染起主要作用，ORP及氮磷含量及N/P比值改變導(dǎo)致偶見種類型改變，改變好氣細(xì)菌群落種群豐富度。因此ORP、濃度既影響好氣微生物群落數(shù)量，同時(shí)改變微生物群落結(jié)構(gòu)。由CCA分析表明、COD、ORP、TP是蘆葦可培養(yǎng)根結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)差異的驅(qū)動(dòng)因子。在驅(qū)動(dòng)因子中，、ORP、TP與好氣細(xì)菌偶見種百分比相關(guān)，說明該濕地凈化系統(tǒng)細(xì)菌群落季節(jié)差異不僅體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)種群的改變上，同時(shí)體現(xiàn)在偶見種群的多少上，偶見種群的百分比與濕地凈化系統(tǒng)的穩(wěn)定性及凈化效率密切相關(guān)。而這種微生物群落群落結(jié)構(gòu)季節(jié)差異很大程度上可以由夏秋植物生長(zhǎng)狀況及代謝活動(dòng)不同，微生物生長(zhǎng)繁殖及活性不同來解釋。在夏季，蘆葦生長(zhǎng)狀況良好，根系的泌氧功能有利于根際氧化還原電位提高，碳(COD)、氮()、磷(TP)及高氧化還原電位促進(jìn)微生物生長(zhǎng)繁殖及活性，細(xì)菌群落度增加，促進(jìn)水體凈化，濕地系統(tǒng)凈化效率提高。在夏季濕地較高凈化效率的基礎(chǔ)之上，功能區(qū)間水質(zhì)差異增大，微生物群落結(jié)構(gòu)空間差異增大，在排序圖中夏季種群分散分布;相反，在秋季，微生物活動(dòng)減弱，植物枯萎，水體碳氮磷濃度增加，氧化還原電位降低，高有機(jī)負(fù)荷抑制微生物生長(zhǎng)及活性［31-32］，細(xì)菌群落密度減少，濕地凈化系統(tǒng)凈化效率降低，好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間差異不明顯，在排序圖中秋季種群集中分布。本研究結(jié)果表明水質(zhì)變量TDS、pH值、Sal是導(dǎo)致夏季好氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間差異的主要水質(zhì)變量。SRW較SCW和SOP具較低TDS、pH值、Sal水平，在SCW和SOP細(xì)菌群落更偏好于較高TDS、Sal濃度及較高pH值。而在SRW，細(xì)菌群落與富營(yíng)養(yǎng)化程度相關(guān)。這可能與濕地功能分布相關(guān)。

據(jù)酶切分類結(jié)果，分別于29 OTUs中隨機(jī)選取分離物進(jìn)行16s rDNA序列測(cè)定，同源性比對(duì)表明:夏季凈化系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)好氣細(xì)菌為葡萄球?qū)?Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)，微小桿菌屬(Exiguobacterium)和芽孢桿菌屬(Bacillus.)，氣單胞菌屬(Aeromonas)，其中氣單胞菌屬分布于夏季凈化系統(tǒng)各功能區(qū)中。秋季人工濕地凈化系統(tǒng)主要好氣細(xì)菌為假單胞菌屬(Pseudomonas)，黃單胞菌屬(Xanthomonadaceae)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中假單胞菌屬為3個(gè)處理區(qū)共有的優(yōu)勢(shì)種。據(jù)已有報(bào)道稱，氣單胞菌在濕地系統(tǒng)氮循環(huán)過程中起重要作用，其生長(zhǎng)受銨離子、氮、磷濃度影響明顯［41］，具有將轉(zhuǎn)化為的能力［42］，腸桿菌耐污能力強(qiáng)，具固氮能力，并抗植物病原體，同時(shí)在磷循環(huán)中起重要作用［10］。葡萄球?qū)偌?xì)菌多為機(jī)會(huì)致病病原菌，對(duì)固氮菌有協(xié)同促進(jìn)作用［43］。秋季主要細(xì)菌種類:假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，及黃單胞菌屬，這幾種菌屬的微生物生長(zhǎng)快速，其中假單胞菌被頻繁的從濕地植物根系周圍分離到，不僅以碳?xì)浠衔餅闋I(yíng)養(yǎng)來源，在去除碳源污染方面起主要作用，還是氨化細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，具很好地去除有機(jī)氮的效果，芽孢桿菌對(duì)大分子結(jié)構(gòu)的有機(jī)物具破壞作用，有效促進(jìn)有機(jī)物的分解［44］?？傊J葦根結(jié)合菌促進(jìn)了水體凈化過程中的植物修復(fù)作用，尤其在氮磷循環(huán)及碳化合物降解去除方面。但是，限于培養(yǎng)法不能直接的反映蘆葦根結(jié)合菌的全部信息，結(jié)合非培養(yǎng)方法分析奧林匹克公園再生水凈化濕地蘆葦根結(jié)合菌對(duì)水體凈化的機(jī)制原理是下一步的工作重點(diǎn)。

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