茉莉酸對(duì)棉花單寧含量和抗蟲相關(guān)酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)

楊世勇，王蒙蒙，謝建春

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241000;2.安徽師范大學(xué)生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000;3.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蕪湖 241000)

誘導(dǎo)抗性是植物界存在的普遍現(xiàn)象，能通過對(duì)昆蟲取食、產(chǎn)卵偏好、繁殖力、發(fā)育歷期、免疫力、解毒力、被捕食和被寄生比率以及生活史其它特征的影響，間接調(diào)控害蟲的種群密度和種群增長［1-7］。茉莉酸(jasmonic acid，JA)是一種具有多種生理功能的植物激素，除調(diào)節(jié)植物的基礎(chǔ)發(fā)育外，還在植物的傷反應(yīng)、臭氧和紫外線暴露、病原菌侵染、昆蟲取食和水分脅迫反應(yīng)中起信號(hào)傳遞的作用，誘導(dǎo)植物直接和間接防御反應(yīng)的發(fā)生［8-9］。JA 及其功能類似物茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate，MeJA)處理后，番茄［1］、甘藍(lán)［2，10］、擬南芥［3］、枸杞［5-6］、豌豆［11］、落葉松［12］、玉米［13-14］、水稻［15］、花生［16］等植物葉片或根部防御相關(guān)酶活性增強(qiáng)、防御性次生代謝物含量或揮發(fā)性有機(jī)物釋放量增加，對(duì)害蟲的抗性提高，但在棉花中相關(guān)研究并不多［7，17-18］，對(duì)棉花抗蟲性誘導(dǎo)的生化機(jī)理、濃度依賴性和持久性尚未見報(bào)道。本研究以棉花幼苗為試材，以不同濃度茉莉酸為誘導(dǎo)子，從棉花幼苗多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase，PPO)、過氧化物酶 (Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性以及棉葉丹寧和胰蛋白酶抑制素(Proteinase inhibitors，PIs)含量的誘導(dǎo)入手，探討茉莉酸誘導(dǎo)棉花幼苗抗蟲性的濃度依賴性和持久性，為農(nóng)業(yè)害蟲的防治和生物安全農(nóng)藥的研發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與茉莉酸處理

供試棉花(Gossypium hirsutum L.)種子皖棉28F1購自蕪湖市城南某種子公司，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研制。將顆粒飽滿的種子于室內(nèi)催芽，待種子露白后播于盛滿黃壤土∶草木灰∶砂子重量比1∶1∶1的塑料花盆(底面半徑r=9 cm;盆高H=15 cm)中于大棚內(nèi)育苗。棚內(nèi)光照約為自然光照的85%。育苗期間根據(jù)情況適時(shí)澆水，無施肥。待幼苗長出2片真葉后，間苗至每盆4株。幼苗長至5—6片真葉時(shí)(出苗后45d左右)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理(包括對(duì)照)，每處理重復(fù)4次。

茉莉酸(≥95%，Sigma-Aldrich)用無水乙醇和蒸餾水稀釋成濃度為0.01、0.1和1.0 mmol/L的溶液。以無水乙醇 +蒸餾水為對(duì)照，用手持式噴霧器向棉株均勻噴施，直到葉面有液滴落下為止。為減少茉莉酸因蒸發(fā)損失，噴施后用透明塑料袋將整株套住，8h后移除塑料袋，并分別于噴施茉莉酸后1、7、14d采集棉花葉片進(jìn)行生化分析。植物樣從每盆的4株植物上采取并混合。

1.2 測定方法

1.2.1 棉葉單寧含量的測定

棉葉單寧含量采用香草醛法進(jìn)行測定［19］。取0.2 g棉葉剪碎后浸入25 mL甲醇中提取2 h，再取上清液和4% 的香草醛-甲醇溶液各2.0 mL，與1.0 mL鹽酸混合后于 30℃水浴中保溫20 min。室溫下用 PG-1810APC(普析通用，北京)分光光度計(jì)測定510 nm下的吸光度值。以不同濃度單寧酸為標(biāo)樣繪制單寧濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算單寧含量。單寧含量用mg/g鮮重表示。

1.2.2 PIs含量的測定

PIs根據(jù)Stout等的方法進(jìn)行測定［20］。準(zhǔn)確稱取0.2 g棉花葉片，用4 mL含有7% 的PVP、1.67 mmol/L苯硫脲、0.3 mol/L KCl和0.4 mmol/L抗壞血酸的 Tris-HCl緩沖液 (50 mmol/L，pH值7.8)研磨成勻漿。再將勻漿在13000 r/min，4°C下離心10 min，上清液用于測定棉胰凝乳蛋白酶含量。測定時(shí)，先在含有0.0015 mg胰凝乳蛋白酶的HCl溶液(1.0 mmol/L)中加入等量提取液混合反應(yīng)10 min，再取100 μL混合液與2.9 mL含有0.5 mmol/L BTEE(N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯)的甲醇-磷酸緩沖液 (pH值 8.0)混勻，于256 nm下測定10 min內(nèi)吸光度的變化值。用BTEE和胰凝乳蛋白酶作對(duì)照。單位時(shí)間內(nèi)吸光度值變化0.01代表生成一個(gè)單位PIs(單位U)，PIs含量用U/g鮮重表示。

1.2.3 PAL、PPO、POD 和 CAT 活性的測定

酶液提取:于冰浴中將0.2 g棉花葉片用1.25 mL含有體積分?jǐn)?shù)7%PVPP的磷酸緩沖液 (0.1 mol/L，pH值7.4)研磨成勻漿，再向勻漿中加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)10%的Trition X-100，混勻后在10000 g，4℃ 下離心10 min。上清液直接用于PPO、POD、CAT和PAL活性測定。酶活性測定溫度為25℃。

PAL活性參照鄒志燕和王振中的方法進(jìn)行測定［21］。在2.80 mL含有L-苯丙氨酸 (20 mmol/L)的硼酸緩沖液 (0.2 mol/L，pH值8.8)中加入20 μL酶提取液，混勻后于290 nm處測定2 min內(nèi)吸光度值的變化。OD290每增加0.01個(gè)單位相當(dāng)于生成了1 μg/mL肉桂酸，PAL活性用μg·g-1鮮重·min-1表示。

PPO活性以鄰苯二酚為底物，參照Tan等的方法進(jìn)行測定［22］。在2.90 mL含有鄰苯二酚 (0.02 mol/L)的磷酸緩沖液 (0.2 mol/L，pH值7.4)中加入100 μL酶提取液，混勻后于420 nm處測定2 min內(nèi)吸光度值的變化。以每分鐘吸光度值變化0.01表示1個(gè)酶活力單位，PPO活性用U·g-1鮮重·min-1表示。

POD活性以愈創(chuàng)木酚為底物，參照Kumari等的方法進(jìn)行測定［23］。在2.99 mL含有0.2% 愈創(chuàng)木酚和0.3%H2O2的磷酸緩沖液 (0.05 mol/L，pH值7.4)中加入10 μL酶提取液，混勻后于470 nm處測定3 min內(nèi)吸光度值的變化。以每分鐘吸光度值變化0.1表示1個(gè)酶活力單位，POD活性用U·g-1鮮重·min-1表示。

CAT活性參照Kumari等的方法進(jìn)行測定［23］。在含有0.3%H2O2的磷酸緩沖液 (0.05 mol/L，pH值7.0)中加入20 μL酶提取液，混勻后于240 nm處測定2 min內(nèi)吸光度值的變化。以每分鐘吸光度值變化0.1表示1個(gè)酶活力單位，CAT活性用U·g-1鮮重·min-1表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

以酶活性和單寧含量為自變量，以茉莉酸濃度和時(shí)間為固定因子，采用單變量多因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并進(jìn)行Tukey HSD多重比較(SPSS 15.0，P=0.05)。濃度和處理后時(shí)間對(duì)酶活性和單寧含量的影響用一維方差分析(One-way analysis of variance)進(jìn)行檢驗(yàn)，并進(jìn)行Tukey HSD多重比較 (P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸處理對(duì)棉花單寧含量的影響

由表1可知，茉莉酸濃度和處理后時(shí)間以及濃度和時(shí)間的交互作用對(duì)棉葉單寧含量影響極顯著(P＜0.001)。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:0.1 mmol/L和1.0 mmol/L茉莉酸處理組棉葉單寧含量均明顯高于對(duì)照 (P ＜0.001);0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于0.01 mmol/L(P ＜0.001)，但和1.0 mmol/L 的差異不顯著 (P=0.057)。

處理后不同時(shí)間單寧含量的多重比較表明:處理后第14天棉葉單寧含量明顯高于第1天和第7天(P＜0.001)，但第1天和第7天棉葉單寧含量差異不明顯 (P=0.106)。

表1 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉單寧含量影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 1 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on tannin contents of cotton leaves

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉單寧含量影響的多重比較表明(圖1):茉莉酸處理后1天，各處理組棉葉單寧含量均明顯高于對(duì)照，但以0.1 mmol/L茉莉酸處理組單寧含量最高，且與0.01 mmol/L和1.0 mmol/L兩處理組存在組間 (P=0.002)差異。處理后7天，0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉單寧含量仍明顯高于對(duì)照和0.01與 1.0 mmol/L處理組 (P 值分別為 ＜ 0.001，0.002和0.001)。處理后 14d，1.0 mmol/L 茉莉酸處理組棉葉單寧含量明顯高于對(duì)照 (P=0.042);0.1和1.0 mmol/L處理組單寧含量明顯高于0.01 mmol/L處理組 (P=0.007 和 0.006)。

圖1 茉莉酸處理對(duì)棉葉單寧含量的影響Fig.1 Effects of JA treatment on tannin content in cotton leaves

2.2 茉莉酸處理對(duì)PIs含量的影響

由表2可知，JA濃度和處理后時(shí)間對(duì)棉葉PIs含量影響極顯著(P＜0.001)。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:0.01 mmol/L和0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉的 PIs含量明顯高于對(duì)照 (P=0.027和0.000)，但 0.1 mmol/L 茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯高于 0.01 mmol/L 和 1.0 mmol/L(P=0.046 和 0.002);0.01 mmol/L和1.0 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果差異不明顯 (P=0.6)。

表2 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉葉PIs含量影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 2 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on PIs contents of cotton leaves

處理后不同時(shí)間PIs含量的多重比較表明:處理后第7天棉葉PIs含量明顯高于第1天(P=0.038)和第14天(P ＜0.001)，但處理后第1天的PIs含量卻明顯高于第14天(P=0.002)。

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉PIs含量影響的多重比較表明 (圖2):處理后1d，0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉PIs含量明顯高于對(duì)照 (P=0.049)，但和其它兩處理組間的差異并不顯著。處理后第7天，0.01 mmol/L和0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉內(nèi)PIs明顯高于對(duì)照 (P=0.032和 0.035)。處理后第 14天，除 0.1 mmol/L茉莉酸處理組和對(duì)照組有顯著差異外 (P＜0.03)，其它各組間的差異不顯著。

圖2 茉莉酸處理對(duì)棉葉PIs含量的影響Fig.2 Effects of JA treatment on PIs content in cotton leaves

2.3 茉莉酸處理對(duì)棉葉PPO活性的影響

由表3可知，JA濃度和處理后時(shí)間以及濃度和時(shí)間的交互作用對(duì)棉葉PPO活性的影響明顯。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:茉莉酸處理組棉葉PPO活性明顯高于對(duì)照 (P ＜0.004);0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯高于 0.01 mmol/L和1.0 mmol/L(P=0.001)，但0.01 mmol/L和1.0 mmol/L組無組間差異。

處理后不同時(shí)間PPO活性的多重比較表明:處理后第7天棉葉PPO活性明顯高于第14天 (P=0.012)，但和第1天差異不明顯 (P=0.52)。

表3 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉葉PPO活性影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 3 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on PPOs activities of cotton leaves

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉PPO活性影響的多重比較表明(圖3):3種濃度茉莉酸處理均提高了棉葉的PPO活性，但各濃度的誘導(dǎo)效應(yīng)不同 (P ＜0.05)。處理后1d和7d，0.1 mmol/L和 1.0 mmol/L 處理組棉葉PPO活性均明顯高于對(duì)照組 (處理后第1天，P=0.002 和 0.038;處理后第7天，P=0.006 和 0.04，但組間差異不明顯)。處理后14d，0.1 mmol/L組棉葉PPO活性明顯高于對(duì)照和1.0 mmol/L組 (P=0.006和0.009)，其它各處理組間差異不明顯。

圖3 茉莉酸處理對(duì)棉葉PPO活性的影響Fig.3 Effects of JA treatment on PPO activity of cotton leaves

2.4 茉莉酸處理對(duì)棉葉PAL活性的影響

由表4可知，JA濃度和處理后時(shí)間對(duì)棉葉PAL活性的影響明顯(P ＜0.001)。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:0.1 mmol/L和1.0 mmol/L茉莉酸處理組棉葉的PAL活性明顯高于對(duì)照 (P ＜0.001)，但0.01 mmol/L茉莉酸處理組較對(duì)照組差異不明顯(P=0.132);0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉的 PAL活性明顯高于0.01 mmol/L組 (P ＜0.001)，但較1.0 mmol/L JA處理組差異不顯著 (P=0.057)。

處理后不同時(shí)間PAL活性的多重比較表明:處理后第7天和第14天棉葉的PAL活性均明顯高于第1天 (P=0.000和0.006)，但第7天和14天棉葉的PAL活性差異不明顯 (P=0.106)。

表4 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉葉PAL活性影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 4 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on PAL activities of cotton leaves

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉PAL活性影響的多重比較表明(圖4):處理后1d各組間PAL活性均無明顯差異。處理后7d，0.1和1.0 mmol/L組PAL活性均明顯高于對(duì)照 (P=0.003和0.007)，但組間差異不明顯(P=0.86)。處理后 14d，0.1 mmol/L 組棉葉 PAL活性明顯高于對(duì)照組和0.01 mmol/L組 (P ＜0.05)，但較1.0 mmol/L茉莉酸處理組差異不明顯。

圖4 茉莉酸處理對(duì)棉葉PAL活性的影響Fig.4 Effects of JA treatment on PAL activities of cotton leaves

2.5 茉莉酸處理對(duì)棉葉POD活性的影響

由表5可知，JA濃度和處理后時(shí)間以及濃度和時(shí)間的交互作用對(duì)棉葉POD活性的影響極顯著 (P＜0.001)。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:0.1 mmol/L和1.0 mmol/L茉莉酸處理組棉葉的POD活性均明顯高于對(duì)照(P ＜0.001);0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯高于0.01 mmol/L和1.0 mmol/L(P ＜0.001)，而1.0 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于 0.01 mmol/L(P=0.041)。

處理后不同時(shí)間POD活性的多重比較表明:處理后第7天和第14天棉葉的POD均明顯低于第1天(P=0.001和0.000)，但第7天和14天棉葉的POD活性差異不明顯。

表5 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉葉POD活性影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 5 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on POD activities of cotton leaves

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉POD活性影響的多重比較表明 (圖5):處理后第1天，0.1 mmol/L和1.0 mmol/L組棉葉POD活性顯著高于對(duì)照 (P ＜0.001)，且存在組間差異 (P ＜0.01)。處理后第7天和14天，0.1 mmol/L組棉葉POD活性均明顯高于其它各組 (P ＜0.01)。

2.6 茉莉酸處理對(duì)棉葉CAT活性的影響

由表6可知，JA濃度以及濃度和時(shí)間的交互作用對(duì)棉葉CAT活性的影響明顯(P ＜0.05)。不同濃度茉莉酸誘導(dǎo)效果的多重比較表明:0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果明顯高于1.0 mmol/L(P=0.005)。雖然0.1 mmol/L和0.01 mmol/L處理的組間差異不明顯，但0.1 mmol/L茉莉酸處理組的 CAT活性卻較0.01 mmol/L茉莉酸處理組高。處理后不同時(shí)間CAT活性的多重比較表明各處理組間CAT活性均無明顯差異。

表6 茉莉酸及茉莉酸處理后時(shí)間對(duì)棉葉CAT活性影響的主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 6 Main effects of JA treatment and time after JA treatment on CAT activities of cotton leaves

圖5 茉莉酸對(duì)棉葉POD活性的影響Fig.5 Effects of JA treatment on POD activities of cotton leaves

圖6 茉莉酸對(duì)棉葉CAT活性的影響Fig.6 Effects of JA treatment on CAT activities of cotton leaves

濃度與處理后天數(shù)對(duì)棉葉CAT活性影響的多重比較表明(圖6):0.01 mmol/L和0.1 mmol/L茉莉酸對(duì)棉葉過氧化氫酶活性有明顯影響 (P ＜0.05)。處理后1d和7d，0.01 mmol/L和0.1 mmol/L茉莉酸處理組棉葉CAT活性均明顯高于對(duì)照(處理后第1天，P=0.008和0.004;處理后第7天，P=0.017和0.005，但組間差異不明顯(圖6)。處理后14d，各組棉葉CAT活性均無明顯差異。

3 討論

茉莉酸是一種具有多種功能的植物生長調(diào)節(jié)物，能通過防御相關(guān)基因的增強(qiáng)表達(dá)和抗蟲相關(guān)化合物的增量合成提高植物的抗蟲性。植物抗性誘導(dǎo)的效率取決于誘導(dǎo)因子施用的時(shí)機(jī)和濃度，誘導(dǎo)抗性只有發(fā)生在食草昆蟲生長和發(fā)育的關(guān)鍵期時(shí)才能發(fā)揮最大效率。本研究表明，茉莉酸在誘導(dǎo)棉花幼苗抗蟲相關(guān)次生代謝物含量和相關(guān)酶活性方面存在濃度依賴性和滯后性。棉花單寧、PIs、PPO、POD、PAL和CAT等對(duì)JA處理的敏感性和滯后期各不相同。

3.1 茉莉酸對(duì)棉花單寧的誘導(dǎo)

單寧又稱植物多酚，能與昆蟲的唾液蛋白和消化酶結(jié)合，引起昆蟲消化酶失活，干擾昆蟲對(duì)植物蛋白的消化吸收［24］。外源茉莉酸或茉莉酸甲酯對(duì)植物單寧含量有一定的誘導(dǎo)作用，但存在濃度依賴性和滯后性。馮遠(yuǎn)嬌等研究外源茉莉酸對(duì)玉米(Zea mays)幼苗化學(xué)防御的系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L茉莉酸處理后48 h玉米葉片總酚含量明顯高于對(duì)照，而其它濃度如0.01，0.05和0.2 mmol/L對(duì)玉米幼苗總酚的誘導(dǎo)不明顯，在48 h以前甚至抑制玉米幼苗的酚酸合成［14］。用更低濃度的 MeJA誘導(dǎo)玉米幼苗異羥肟酸 (hydroxamic acid)和酚酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，1 μL/L和2 μL/L(約0.005 mmol/L和 0.01 mmol/L)的MeJA 處理后 48 h，處理組幼苗葉內(nèi)酚酸含量明顯高于對(duì)照［25］，但10 mmol/L JA對(duì)玉米葉片總酚的誘導(dǎo)只局限在處理后 3—6 h［13］。Moreira等研究發(fā)現(xiàn)，用5 mmol/L MeJA處理海岸松 (Pinus pinaster)幼苗后60d，針葉的總酚含量升高不明顯［26］。本研究沒有采用低于0.01 mmol/L和高于1.0 mmol/L的JA對(duì)棉花幼苗進(jìn)行處理，也沒有測定24 h以內(nèi)JA的快速誘導(dǎo)效應(yīng)，但不排除更低或更高濃度JA對(duì)棉花幼苗單寧含量的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)所采用的3種濃度的茉莉酸均能在14d內(nèi)誘導(dǎo)棉花幼苗葉片單寧含量升高。如果采樣時(shí)間延長，可能也會(huì)發(fā)現(xiàn)更長的誘導(dǎo)滯后期。

茉莉酸及功能類似物誘導(dǎo)植物抗性的濃度依賴性和滯后期表明，茉莉酸、茉莉酮和茉莉酸甲酯都能誘導(dǎo)落葉松單寧含量明顯升高，且以0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果最好，滯后期為10—20d［12］。宮玉艷等對(duì)枸杞的研究表明，0.1 mmol/L茉莉酸處理5d后，枸杞葉片單寧酸含量增幅最大［6］。海岸松經(jīng)40 mmol/L MeJA處理后2周，針葉內(nèi)總酚含量比對(duì)照植物高1.9倍［27］。本研究發(fā)現(xiàn)0.1和1.0 mmol/L茉莉酸在誘導(dǎo)棉葉單寧含量上等效，JA處理后第14天單寧含量最高，在誘導(dǎo)最佳濃度和滯后期方面分別與枸杞［6］、落葉松［12］和玉米［14］、海岸松［27］等相似。

3.2 茉莉酸對(duì)棉葉PIs和 PPO的誘導(dǎo)

PPO是與植物抗蟲性密切相關(guān)的抗?fàn)I養(yǎng)蛋白，其催化酚氧化所生成的醌極易攻擊并烷基化某些必需氨基酸如半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和甲氨酸，引起昆蟲營養(yǎng)失調(diào)，抑制幼蟲生長和發(fā)育［28］。PIs亦稱抗消化蛋白酶，能通過抑制昆蟲中腸消化酶活性而影響昆蟲對(duì)植物營養(yǎng)的獲取、吸收、發(fā)育，甚至引起幼蟲死亡［29］。前人研究發(fā)現(xiàn)，番茄幼苗經(jīng)1.5 mmol/L茉莉酸甲酯處理后4d，葉片PPO和PIs活性明顯升高［22］。1—2年生油松經(jīng)0.1 mmol/L茉莉酸甲酯(濃度根據(jù)原文計(jì)算而得)處理48 h后，球果的PPO活性與PIs含量均明顯高于對(duì)照［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花幼苗經(jīng)0.01、0.1和1.0 mmol/L 3種濃度 JA處理后，PIs含量和 PPO活性均不同程度升高，說明外源JA能通過誘導(dǎo)棉花抗?fàn)I養(yǎng)酶和抗消化酶活性而提高棉花幼苗的抗蟲性。另有研究發(fā)現(xiàn)，0.1、0.5、1.0 和 5.0 mmol/L 茉莉酸甲酯也能誘導(dǎo)番茄葉片 PIs含量上升，持久期可達(dá) 2 周［31］。木豆(Cajanus cajan)經(jīng) 0.1 mmol/L茉莉酸甲酯處理后 24 h，葉片的 PIs活性明顯升高［32］。輻射松 (Pinus radiata)幼苗經(jīng)4.5 mmol/L茉莉酸甲酸處理后4d，針葉的 PPO活性比對(duì)照高2.3倍，但當(dāng) MeJA濃度高于4.5 mmol/L時(shí)，卻對(duì)幼苗有毒［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)的滯后期可達(dá)2周，但以JA處理后第7天棉葉的PIs含量和PPO活性最高，并沒有觀察到JA對(duì)棉花幼苗的植物毒性。就誘導(dǎo)的最佳濃度而言，與李新崗等對(duì)輻射松［30］和 Lomate和 Hivarel［33］對(duì)木豆的研究相同;就誘導(dǎo)的滯后期而言，與Fujimoto等［31］對(duì)番茄的研究類似。雖然也有研究表明茉莉酸甲酯在誘導(dǎo)番茄 PIs含量上效果不明顯［34］，但本研究所使用的3種濃度均在一定程度上誘導(dǎo)了棉花幼苗PIs含量的升高。

3.3 茉莉酸對(duì)棉葉PAL的誘導(dǎo)

茉莉酸處理能提高葉片的PAL活性［21，35］。豌豆幼苗經(jīng)JA處理后葉片PAL活性明顯上升［35］。水稻幼苗經(jīng)0.1 mmol/L茉莉酸處理后PAL活性升高，抗稻瘟性也隨之增強(qiáng)，持久期可長達(dá)15d［21］。本研究表明，0.1和1.0 mmol/L茉莉酸在誘導(dǎo)棉花幼苗PAL活性方面等效(經(jīng)方差分析差異不顯著)，誘導(dǎo)的滯后期可達(dá)1—2周，結(jié)果與鄒志燕和王振中［21］對(duì)水稻的研究基本相同。此外，有研究表明0.1 mmol/L的茉莉酸甲酯能誘導(dǎo)石蒜 (Lycoris radiata)PAL基因的表達(dá)［36］。由于PAL是酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶和限速酶［37］，JA處理后棉花幼苗PAL活性上升，說明茉莉酸激活或直接參與了棉花幼苗的苯丙烷代謝途徑，在提高棉花幼苗防御性次生代謝物含量方面起重要作用。

3.4 茉莉酸對(duì)棉葉抗氧化酶POD和CAT的誘導(dǎo)

POD參與酚的氧化，生成對(duì)病原菌毒性較高的醌類化合物，并參與木質(zhì)素的合成，增厚細(xì)胞壁以抵御病菌的入侵和擴(kuò)散。CAT能將逆境條件下(包括昆蟲取食)植物葉綠體和線粒體產(chǎn)生的過量H2O2分解，減輕活性氧成分對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害。前人研究表明，250 μmol/L茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)水稻保護(hù)酶系POD和CAT活性升高［15］。25、100和250 μmol/L茉莉酸處理提高了7日齡花生幼苗 (Arachis hypogaea L.)根和葉片的POD和CAT活性［23］。茉莉酸處理枸杞幼苗后7d枸杞葉POD活性升高，但0.01 mmol/L茉莉酸的誘導(dǎo)效果最佳［6］。本研究JA對(duì)棉花POD和CAT的誘導(dǎo)效應(yīng)表明，0.1 mmol/L莉酸處理明顯提高了棉葉的 POD和CAT活性，誘導(dǎo)效應(yīng)可持續(xù)1—14d，誘導(dǎo)的滯后期與宮玉艷對(duì)枸杞和Kumari等對(duì)花生的研究基本相同［6，23］。也有研究表明，感染晚疫病的馬鈴薯(Solanum tuberosum)幼苗經(jīng)10-4mmol/L茉莉酸處理后，葉片POD活性升高而CAT活性下降［38］。Makissimov等認(rèn)為:外源茉莉酸處理后，馬鈴薯葉片可溶性POD活性升高，與晚疫菌(Phytophthora infestans)菌絲體的親和力增加，起抑制病原菌擴(kuò)散的作用;CAT活性的下降則削弱JA誘導(dǎo)的馬鈴薯抗病性，因?yàn)镃AT催化分解H2O2［38］。本研究中，棉花幼苗經(jīng)外源JA處理后葉片CAT活性上升，與Makissimov等［38］的報(bào)道相反，產(chǎn)生差異的原因可能是二者研究的系統(tǒng)、采用的JA濃度和處理后采樣時(shí)間不同。Makissimov等的研究對(duì)象是被晚疫菌感染的馬鈴薯植株，而本實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是健康的棉花植株。另外，茉莉酸除可以誘導(dǎo)植株抗病、抗蟲性外，還能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生H2O2［35，38］，而過氧化氧酶在清除多余H2O2、保持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用。據(jù)此推測，本研究中所觀察到的CAT活性升高，可能是所使用的茉莉酸誘導(dǎo)了棉花葉片的氧猝發(fā)。處理后第14天時(shí)CAT活性與對(duì)照相比無明顯差異，可能是JA誘導(dǎo)的氧猝發(fā)隨處理時(shí)間延長逐漸減弱的緣故。

棉葉中豐富的單寧和棉酚能抑制或減輕綠盲蝽 (Apolygus lucorum)的危害［39］、抑制棉鈴蟲化蛹［40］，甚至直接起毒殺作用［11］。PPO明顯抑制棉鈴蟲的增重和取食［41］。PIs也在番茄和馬鈴薯的抗棉鈴蟲中起重要作用［34，42］。雖然本研究沒有直接關(guān)注JA誘導(dǎo)棉花對(duì)棉鈴蟲等害蟲的影響，但茉莉酸及其功能類似物的誘導(dǎo)抗蟲性表明:2.0 mmol/L茉莉酸處理的 Bt棉葉大大降低了草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的相對(duì)生長率［7］。4齡棉鈴蟲取食MeJA處理過的番茄 (Tainan ASVEG No.6)葉后，死亡率高達(dá)100%［34］，外源茉莉酸處理的枸杞苗木和水稻幼苗使枸杞蚜和稻褐飛虱若蟲的發(fā)育歷期延長［5，43］。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花幼苗經(jīng)茉莉酸處理后，單寧和抗消化酶含量上升、抗?fàn)I養(yǎng)酶和抗氧化酶活性升高。因此，根據(jù)前人和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測，茉莉酸處理能提高棉花幼苗的抗蟲性。另外，由于植物對(duì)茉莉酸誘導(dǎo)存在濃度依賴性、發(fā)育階段特異性和物種專一性［30，44-45］，開展茉莉酸的誘導(dǎo)抗性實(shí)驗(yàn)時(shí)除應(yīng)該多設(shè)濃度梯度外，還應(yīng)關(guān)注研究對(duì)象的發(fā)育階段。未來應(yīng)進(jìn)一步采用分析化學(xué)的方法對(duì)茉莉酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗蟲性次生代謝物進(jìn)行定性和定量分析，從棉花誘導(dǎo)防御對(duì)棉鈴蟲等害蟲的取食行為、產(chǎn)卵偏好、生態(tài)免疫和解毒功能、從可誘導(dǎo)揮發(fā)物對(duì)棉鈴蟲捕食性/寄生性天敵的影響等多個(gè)營養(yǎng)級(jí)層面進(jìn)行綜合研究，揭示茉莉酸誘導(dǎo)普通棉抗蟲性的生理、生態(tài)和生化機(jī)制。

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