貝前列素促進野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠肺動脈細胞凋亡

劉 亞，田紅燕，閆曉麗，王文平，范粉靈

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安710061)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是以肺循環(huán)阻力進行性升高，并最終導致右心功能不全為特點的一組慢性疾病，具有進展迅速，預后差的特點［1］。肺動脈結(jié)構(gòu)的重塑是肺動脈高壓的重要病理改變。既往認為，肺動脈重塑是肺動脈局部細胞大量增殖、堆積的結(jié)果。然而，肺動脈細胞凋亡減少也是肺動脈高壓血管重構(gòu)的重要原因，且與肺動脈內(nèi)丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)增加有關(guān)［2］，但肺動脈細胞凋亡減少的原因和機制目前還不清楚。肺動脈高壓時，肺動脈內(nèi)皮細胞釋放前列環(huán)素減少，導致肺動脈平滑肌細胞增殖增加，是肺動脈重塑的原因［3］。然而，前列環(huán)素對肺動脈重構(gòu)的促進作用是否還與其減少后抑制肺動脈細胞凋亡有關(guān)呢?本研究以貝前列素(beraprosat)為對象，觀察前列環(huán)素對肺動脈凋亡的影響，希望為進一步認識肺動脈肺高壓的病理機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

野百合堿(Sigma公司)，Beraprosat(北京泰德制藥股份有限公司)，TUNEL試劑盒(Promega公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR試劑盒(Takara公司)，GAPDH抗體(Epitomics公司)，BAX及BCL-2抗體(Cell Signaling Technology公司)，PDK(Enzo Life Sciences公司)，山羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～250 g［西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(陜西)2007-001］，隨機均分為對照(control)組(n=10)、野百合堿 (MCT)組(n=10)及貝前列素(beraprosat)組(n=10)。MCT及beraprosat組給予MCT 60 mg/kg腹腔注射，control組給予等體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。第2天起，beraprosat組每天給予 Beraprosat 200 μg/kg灌胃，control及MCT組給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，直至第21天。

1.3 肺動脈血流動力學及右心肥厚指數(shù)測定

測量肺動脈壓力，稱量右心室(RV)、左心室及室間隔的重量(LV+S)，計算右心肥厚指數(shù)=RV/(LV+S)。

1.4 留取組織標本

分離大鼠左肺2～3級肺動脈，液氮保存。分離大鼠右肺下葉，4%多聚甲醛固定8 h后，采用20%蔗糖浸泡過夜，OCT包埋，冰凍切片機將組織切成10 μm組織切片。

1.5 肺動脈結(jié)構(gòu)的觀察

將組織切片行HE染色，選取外徑50～200 μm的肌性小動脈，觀察動脈管壁厚度。動脈管壁厚度(%)=(血管外徑－血管內(nèi)徑)/血管外徑×100%

1.6 肺動脈細胞凋亡觀察

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導的d-UTP缺口末端標記技術(shù)(TUNEL)，觀察肺動脈細胞凋亡。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR)

采用Trizol法提取肺動脈總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR檢測目的RNA水平。引物序列如下:GAPDH:5-AGAACATCATCCCTGCAT CCA，5-GCCTGCTTCACCACCTCTTG;BAX:5-GGA GATGAACTGGACAATAATATG，5-CAAAGTAGAAGA GGGCAACC;BCL-2:5-GCAGAGATGTCCAGTCAG，5-CAGAGCGATGTTGTCCAC;PDK:5-CGACAGACTC TTCAACTAC，5-AGCCTTAATATAGATGACAGC。

1.8 Western blot

提取肺動脈總蛋白，蛋白變性，使用12%的SDS-PAGE分離蛋白;采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，使用5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h;封閉完成后，漂洗NC膜，并在其上加入一抗于4℃過夜;次日清晨，漂洗NC膜，加入二抗室溫1 h;二抗孵育結(jié)束后，顯色。一抗?jié)舛确謩e為:抗GAPDH 1∶1 000;抗 BAX 1∶1 000;抗 BCL-2 1∶1 000;抗 PDK 1∶1 000，一抗均為兔抗大鼠，二抗為山羊抗兔，使用濃度為1∶5 000。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)，3組之間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 貝前列素對肺動脈壓力的影響

MCT組大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)和右心肥厚指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)，貝前列素組顯著回降(P＜0.05)，接近正常組水平(表1)。

2.2 貝前列素對肺動脈結(jié)構(gòu)的影響

MCT組大鼠肺動脈壁厚度顯著增加(P＜0.05)(圖1)，肺動脈內(nèi)細胞凋亡顯著減少(P＜0.05)(圖2)，貝前列素干預使肺動脈壁厚度顯著回降(圖1)、肺動脈內(nèi)凋亡細胞顯著回升(P＜0.05)(圖2)。

2.3 貝前列素對BAX，BCL-2及PDK mRNA的影響

MCT組大鼠肺動脈內(nèi)BAX mRNA水平顯著降低(P＜0.05)，BCL-2和PDK mRNA水平顯著增加(P＜0.05)，貝前列素組BAX mRNA水平顯著回升(P＜0.05);BCL-2及PDK mRNA顯著回降(P＜0.05)(圖 3)。

表1 貝前列素對肺動脈壓力和右心肥厚指數(shù)的影響Table 1 The role of beraprosat on mPAP and right ventricular hypertrophy index(x ± s，n=7)

圖1 貝前列素對肺動脈壁的影響Fig 1 The role of beraprosat on pulmonary artery wall thickness(n=7)(×400)

2.4 貝前列素對BAX，BCL-2及PDK蛋白表達的影響

MCT組大鼠肺動脈內(nèi)BAX蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，BCL-2和PDK蛋白水平顯著升高(P＜0.05)，貝前列素使BAX蛋白水平顯著回升(P＜0.05)，BCL-2及 PDK蛋白水平顯著回降(P＜0.05)(圖4)。

圖4 貝前列素對BAX、BCL-2及PDK蛋白水平的影響Fig 4 The role of beraprosat on the protein level of BAX，BCL-2 and PDK(n=7)

3 討論

前列環(huán)素(PGI2)是膜磷脂釋放的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生［4］。在肺動脈，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生PGI2，引起平滑肌細胞舒張，抑制平滑肌細胞增殖。肺動脈高壓時，內(nèi)皮細胞損傷，釋放PGI2減少，肺動脈平滑肌細胞收縮和增殖，肺動脈重塑［3］。前列環(huán)素類藥物是最早應用于肺動脈高壓靶向治療的藥物，通過補充外源性的前列環(huán)素達到有效降低肺動脈壓力和改善肺動脈重塑的作用［5］。Beraprost是首個口服前列環(huán)素類藥物，雖然用于肺動脈高壓治療的長期療效還有爭議，但是，貝前列素與其他肺動脈高壓治療的靶向藥物聯(lián)用較單獨使用這些藥物有著更好的效果，可能與其不同的作用機制有關(guān)［6］。

肺動脈高壓時，肺動脈重塑的形成是肺動脈內(nèi)各種細胞增殖增加與凋亡減少共同作用的結(jié)果［7］，細胞內(nèi)PDK增加，抑制線粒體代謝［8］，阻止線粒體內(nèi)膜 BAX和BCL-2釋放到細胞質(zhì)，抑制細胞凋亡［2，9］。

本研究發(fā)現(xiàn)，MCT肺動脈高壓大鼠肺動脈內(nèi)細胞凋亡減少，肺動脈內(nèi)BAX降低，BCL-2和PDK升高，貝前列素在預防MCT誘導肺動脈壓力升高、肺動脈重塑過程中，伴有肺動脈內(nèi)細胞凋亡的增加。同時，貝前列素干預使肺動脈內(nèi)BAX回升，BCL-2和PDK回降。因此，貝前列素改善肺動脈重構(gòu)的作用可能與其促進肺動脈細胞凋亡有關(guān)。

這可能是因為:PGI2除與細胞膜上的PGI2受體結(jié)合外，還能與核受體PPAR結(jié)合［4］，通過細胞內(nèi)BAX 和 BCL-2［10］，促進多種細胞［11－12］凋亡。貝前列素鈉在促進肺動脈細胞凋亡的過程中，也伴有BAX和BCL-2凋亡途徑的異常，故推測，貝前列素促進細胞凋亡可能與活化細胞內(nèi)PPAR有關(guān)，但具體機制還有待研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，貝前列素可以通過促進肺動脈細胞凋亡改善肺動脈高壓的肺血管重塑，但是其具體機制還有待于進一步的研究。

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