重組腺病毒Ad-IL-12感染淋巴細(xì)胞對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖和凋亡的影響

王 秦，成 鳳，匡文斌，董晉豫，馬婷婷，熊海玉，涂植光

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，重慶400016)

卵巢癌是臨床上常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，目前國(guó)內(nèi)卵巢癌的治療主要以外科手術(shù)為主，同時(shí)輔以化療、放療或者其他的治療方法。由于卵巢癌惡性程度高，對(duì)化療、放療不敏感，卵巢癌成為女性生殖器惡性腫瘤中病死率最高的腫瘤［1－2］。

近年來(lái)，腫瘤的基因治療成為人們研究的熱點(diǎn)，目前常用的載體主要有病毒載體和非病毒載體，其中腺病毒具有制備方便、轉(zhuǎn)染效率高、不整合宿主染色體等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地作為腫瘤的基因治療載體，尤其近年來(lái)新型嵌合型腺病毒Ad5F35的廣泛應(yīng)用，使造血干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞及NK細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染血液細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染和高效表達(dá)成為可能［3－5］。

本研究探討過(guò)表達(dá)人IL-12的淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用，為進(jìn)一步研究腫瘤局部微環(huán)境免疫反應(yīng)和IL-12的基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3(本實(shí)驗(yàn)室保存)，肝素鈉抗凝全血標(biāo)本5 mL經(jīng)健康供血者知情同意后獲取，Ad-GFP(本實(shí)驗(yàn)室保存)，人IL-12重組腺病毒 Ad-IL-12(本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建)［6］。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Maker(TaKaRa公司)，人IL-12 P70 ELISA檢測(cè)試劑盒(R＆D公司)，磷酸鹽平衡鹽溶液(武漢博士德公司)，人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque PLUS(GE公司)，D-Hanks緩沖液(Hyclone公司)，劉氏染液(珠海貝索生物技術(shù)公司)，孔徑0.4 μm共培養(yǎng)小室(Corning公司)，RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco公司)，CCK-8試劑盒和AnnexinⅤ-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)，兔抗人BCL-2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗人survivin多克隆抗體(Anbo Biotechnology公司)。IL-12 P35、P40 引物，Survivin，BCL-2 和 β-actin引物由大連寶生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞SKOV3用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 pg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每日于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞每日換液，隔日傳代1次，均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng):無(wú)菌抽取新鮮肝素鈉抗凝全血標(biāo)本5 mL，向血液中按照1∶1比例加入D-Hanks緩沖液，輕輕混勻后吸取5 mL細(xì)胞懸液緩慢加在5 mL的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫2 000 r/min離心20 min，離心后收集環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞，加入D-Hanks緩沖液洗滌細(xì)胞3次，最后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后收集懸浮細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞，細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.3 重組腺病毒Ad-IL-12感染人外周血淋巴細(xì)胞:人外周血淋巴細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞接種6孔板，每個(gè)孔中加入2 mL含l0%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，設(shè) SKOV3組，SKOV3/Ad-GFP組，SKOV3/Ad-IL-12組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，SKOV3組是空白對(duì)照，不加入病毒，SKOV3/Ad-GFP組和 SKOV3/Ad-IL-12組分別加入感染復(fù)數(shù)為100的Ad-GFP和Ad-IL-12病毒，孵育48 h后觀察計(jì)數(shù)熒光染色細(xì)胞的比值并采集圖片。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)IL-12雙亞基P35和P40的mRNA表達(dá)情況:收集培養(yǎng)48 h的3組淋巴細(xì)胞(SKOV3組，SKOV3/Ad-GFP組，SKOV3/Ad-IL-12組)，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下:β-actin基因(NM-001101.3)上游引物為:5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'，下游引物為:5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為564 bp;P40基因(NM_002187.2)上游引物為:5'-GTGGAGTGCCAGGAGGACA-3'，下游引物為:5'-TCTTGGGTGGGTCAGGTTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為148 bp;P35基因(NM_000882.3)上游引物為:5'-CTGGACCACCTCAGTTTGG-3'，下游引物為:5'-TCAGAAGTGCAAGGGTAAAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為155 bp，PCR反應(yīng)條件均為:94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后充分延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(2.5%)電泳鑒定，采用Quantity One軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-12 P70蛋白:收集培養(yǎng)72 h的3組細(xì)胞培養(yǎng)上清，10 000 r/min離心5 min，吸取上清，按照人IL-12 P70 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Ad-IL-12及Ad-GFP感染的人外周血淋巴細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng):取新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)為1×106個(gè)，設(shè)SKOV3組，SKOV3/Ad-GFP組，SKOV3/Ad-IL-12組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，SKOV3/Ad-GFP組和SKOV3/Ad-IL-12組加入感染復(fù)數(shù)為100的相應(yīng)病毒感染淋巴細(xì)胞48 h后，再與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞接種在共培養(yǎng)小室上層，每孔細(xì)胞總數(shù)為2×105個(gè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 CCK8檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖:取共培養(yǎng)72 h后的3組SKOV3細(xì)胞加入到96孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)為1×104個(gè)并加入200 μL與共培養(yǎng)體系對(duì)應(yīng)的舊培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)立 SKOV3組，SKOV3/Ad-GFP組，SKOV3/Ad-IL-12組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)平行孔，分別在1～5 d內(nèi)定時(shí)按照CCK8說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞周期:外周血淋巴細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，收集3組SKOV3細(xì)胞，70%冰乙醇中固定細(xì)胞后送重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院兒研所檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡:采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)共培養(yǎng)24、48、72 h后SKOV3細(xì)胞的凋亡峰，再按照AnnexinⅤ-PE/7-AAD試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)出現(xiàn)凋亡峰的時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的SKOV3細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10 RT-PCR檢測(cè)抗凋亡基因 survivin、BCL-2 mRNA的表達(dá):收集共培養(yǎng)72 h后的各組SKOV3細(xì)胞，Trizol抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。以人β-actin為內(nèi)參，RT-PCR法分別檢測(cè)各組細(xì)胞抗凋亡基因survivin，BCL-2 mRNA的表達(dá)。引物序列如下:BCL-2基因(NM-000657.2)上游引物為:5'-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，下游引物為:5'-CACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為153 bp;survivin基因(NM_001168.2)上游引物為:5'-TTCTCAAGGACCACCGCATCT-3'，下游引物為:5'-CGCACTTTCTCCGCAGTTTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為358 bp。

1.2.11 Western blot檢測(cè)survivin、BCL-2蛋白的表達(dá):收集共培養(yǎng)72 h后的各組SKOV3細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。取90 μg細(xì)胞蛋白提取液，采用12%的分離膠分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，分別與兔抗人 survivin、BCL-2多克隆抗體(1∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜后，與二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶1 000稀釋)37℃孵育2 h，洗滌后用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Ad-IL-12成功感染人外周血淋巴細(xì)胞

重組腺病毒感染人外周血淋巴細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)Ad-IL-12和Ad-GFP均能夠成功感染人外周血淋巴細(xì)胞，在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，感染效率分別為(95±1)%和(92±1)%(圖1)。

2.2 Ad-IL-12感染外周血淋巴細(xì)胞48 h后IL-12 mRNA表達(dá)情況

與SKOV3組和感染Ad-GFP的淋巴細(xì)胞相比，Ad-IL-12感染的淋巴細(xì)胞能擴(kuò)增出大小為148 bp的P40亞基和155 bp的P35亞基目的條帶(圖2)。

2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12 P70的表達(dá)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=489.2x－57.29(R2=0.994)計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清中的人IL-12 P70濃度，SKOV3/Ad-IL-12組濃度是263 pg/mL，而 SKOV3組和 SKOV3/Ad-GFP組均未檢出。

2.4 過(guò)表達(dá)IL-12的人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖活性的影響

前3天3組SKOV3細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異，到第4天，與 SKOV3組和 SKOV3/Ad-GFP組相比，SKOV3/Ad-IL-12組的SKOV3細(xì)胞增殖率顯著下降(P＜0.05)(圖3)。

2.5 過(guò)表達(dá)IL-12的人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的影響

共培養(yǎng)72 h后，與SKOV3/Ad-GFP組和SKOV3組相比，SKOV3/Ad-IL-12組的SKOV3細(xì)胞G1期百分比顯著升高(P＜0.05)(圖4，表1)。

2.6 過(guò)表達(dá)IL-12的人外周血淋巴細(xì)胞升高SKOV3細(xì)胞凋亡率

共培養(yǎng)24和48 h，3組細(xì)胞均未出現(xiàn)凋亡峰，共培養(yǎng)72 h后，與 SKOV3組和 SKOV3/Ad-GFP組相比，SKOV3/Ad-IL-12組的SKOV3細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的凋亡峰(圖5)。AnnexinⅤ-PE/7-AAD法檢測(cè)出SKOV3/Ad-IL-12組細(xì)胞凋亡率(2.40±0.52)%顯著高于SKOV3組(0.64±0.10)%和SKOV3/Ad-GFP組(0.83±0.03)%(圖6，表1)。

2.7 過(guò)表達(dá)IL-12的人外周血淋巴細(xì)胞下調(diào)SKOV3細(xì)胞survivin、BCL-2 mRNA的表達(dá)

共培養(yǎng)72 h后，與SKOV3/Ad-GFP組和SKOV3組相比，SKOV3/Ad-IL-12組的SKOV3細(xì)胞survivin、BCL-2 mRNA水平顯著下調(diào)(P＜0.05)(圖7)。

2.8 過(guò)表達(dá)IL-12的人外周血淋巴細(xì)胞下調(diào)SKOV3細(xì)胞 survivin、BCL-2 蛋白

共培養(yǎng)72 h后，與SKOV3/Ad-GFP組和SKOV3組相比，SKOV3/Ad-IL-12組SKOV3細(xì)胞的抗凋亡蛋白survivin、BCL-2均顯著下調(diào)(P＜0.05)(圖8)。

3 討論

人白細(xì)胞介素 12(humaninterleukin-12，hIL-12)是由P35和P40兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，主要由單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生。它可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)NK和LAK細(xì)胞的殺傷水平和黏附分子的表達(dá)等［7］。早在2000年，國(guó)外已生產(chǎn)出重組人IL-12應(yīng)用于抗腫瘤治療，并進(jìn)行了一、二期臨床實(shí)驗(yàn)，但是臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)全身應(yīng)用外源性的IL-12存在不良反應(yīng)大，半衰期短等問(wèn)題，所以如何能讓IL-12在腫瘤局部高效持續(xù)的表達(dá)成為研究難題。近年來(lái)，腫瘤的基因治療技術(shù)得到極大的發(fā)展，IL-12基因疫苗、微粒體攜帶IL-12、IL-12重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入瘤體等方法都得到了較好的抗腫瘤效果［8－10］，也有報(bào)道指出，在結(jié)腸癌中采用腺病毒載體運(yùn)載IL-12基因聯(lián)合化療藥物可以更好地在腫瘤局部發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)［11－12］。所以本研究采用具有高轉(zhuǎn)染率的腺病毒載體作為IL-12基因治療的載體。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞周期分布Fig 4 The cell cycle distribution of SKOV3 cells in different groups detected by FCM

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響Table 1 The cell cycle distribution and apoptosis rate of SKOV3 cells in different groups detected by FCM(±s，%，n=3)

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響Table 1 The cell cycle distribution and apoptosis rate of SKOV3 cells in different groups detected by FCM(±s，%，n=3)

*P ＜0.05 compared with SKOV3 group and SKOV3/Ad-GFP group．

group apoptosis G1 S G2 SKOV3 0.64±0.10 33.41±0.78 66.43±1.02 0.17±0.02±0.04 0.29 SKOV3/Ad-GFP 0.83±0.03 29.34±0.77 70.66±0.77 0 SKOV3/Ad-IL-12 2.40±0.52* 53.74±0.29* 46.24±0.27*

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL-12可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間，減少腫瘤轉(zhuǎn)移等，但是人們對(duì)IL-12的抗腫瘤機(jī)制卻不甚清楚，有的認(rèn)為IL-12是通過(guò)刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ來(lái)發(fā)揮作用，有的認(rèn)為IL-12是通過(guò)體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，在不同的腫瘤中有不同的細(xì)胞因子的相互作用，從而導(dǎo)致不同的抗瘤效果。目前較為普遍的觀點(diǎn)是:IL-12發(fā)揮抗瘤作用需要有免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞的參與。所以本研究采用IL-12效應(yīng)細(xì)胞之一的外周血淋巴細(xì)胞作為其基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞。

本研究采用重組腺病毒載體Ad-IL-12成功感染人外周血淋巴細(xì)胞并可持續(xù)表達(dá)分泌人IL-12 P70蛋白。過(guò)表達(dá)IL-12的外周血淋巴細(xì)胞可以使與之共培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3周期阻滯在G1期，凋亡率升高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)SKOV3細(xì)胞的抗凋亡蛋白BCL-2和survivin顯著下調(diào)，從而有效地抑制了細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究表明，在局部存在高表達(dá)IL-12淋巴細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境中，卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為得到抑制，為后續(xù)研究卵巢癌基因治療提供了依據(jù)，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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