反相高效液相色譜法測(cè)定O/W型二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素含量＊

王 熒 ，馬玉樊 ，盧婷利 ，陳 濤 ，2，3

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072; 2.陜西脂質(zhì)體工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710075;3.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 710075)

青蒿素是從菊科植物黃花蒿中提取分離的一種有效的新型倍半萜內(nèi)酯化合物，具有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)。二氫青蒿素由青蒿素C－10羰基還原得到[1]，具有快速、高效、低毒性的特點(diǎn)，同時(shí)可以預(yù)防和治療血吸蟲(chóng)病，抗腫瘤及皮膚病等多種疾病，是值得開(kāi)發(fā)且具有良好應(yīng)用前景的中藥品種[2－7]。但由于其水溶性差、生物利用度低，目前研究的新型載藥體系如脂質(zhì)體、微球并不能增強(qiáng)二氫青蒿素的抗瘧效果[8－12]。因此，為提高二氫青蒿素的生物利用度及其抗瘧效果，筆者將二氫青蒿素包封于脂肪乳油相中，制成O/W型脂肪乳劑，且采用反相高效液相色譜法測(cè)定二氫青蒿素脂肪乳制劑中二氫青蒿素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀，包括Waters2996型紫外檢測(cè)器，Waters 717型自動(dòng)進(jìn)樣器，WatersMillennium色譜工作站;實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)NS 1001L型(意大利Niro Soavi)。二氫青蒿素對(duì)照品和原料(陜西匯生醫(yī)藥科技有限公司，對(duì)照品含量高于99%，制劑原料含量98%);國(guó)產(chǎn)精制蛋黃卵磷脂(西安力邦制藥有限公司，PC含量85%)，大豆油、甘油和維生素E等其他試劑為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。二氫青蒿素脂肪乳(1 g/L)、空白脂肪乳為自制品。

2 方法與結(jié)果

2.1 二氫青蒿素脂肪乳制備

取精制大豆油10 g，加入1.2 g精制蛋黃卵磷脂、維生素E 0.2 g和二氫青蒿素 0.1 g，加熱攪拌約 10～20min，混勻。另取注射用水 70mL，加入甘油 2.25 g、F68 2.6 g、油酸鈉 0.1 g。在氮?dú)獗Ｗo(hù)和攪拌條件下，將油溶液緩慢加入水溶液中，調(diào)節(jié)總量至100mL。于高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)10min，均質(zhì)壓力為850 bar，得到的二氫青蒿素脂肪乳的粒徑為150～250 nm，調(diào)節(jié)pH 6.0～8.5，過(guò)濾，分裝，通入氮?dú)?，密封?21℃滅菌15 min，燈檢合格后，包裝。合格的乳劑應(yīng)該是均勻的乳狀溶液，沒(méi)有沉淀、分層和飄油現(xiàn)象。試驗(yàn)用空白脂肪乳即不含藥物的脂肪乳按照同樣工藝制備，并同在室溫保存。

2.2 溶液制備

精密稱取二氫青蒿素對(duì)照品10.0mg，置10 mL棕色容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定溶至刻度，搖勻，0.22μm濾膜過(guò)濾，即得1 g/L的對(duì)照品溶液。精密量取二氫青蒿素脂肪乳100μL，加無(wú)水乙醇溶解并定溶至3mL，搖勻，0.22μm濾膜過(guò)濾即得供試品溶液。精密量取空白脂肪乳100μL，加無(wú)水乙醇溶解并定溶至3mL，搖勻，0.22μm濾膜過(guò)濾，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agilent HC －C18柱(250mm × 4.6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水(60∶40，V ∶V);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):216 nm;進(jìn)樣量:20μL。

2.4 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn):取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，對(duì)照品和供試樣品溶液中二氫青蒿素色譜峰保留時(shí)間和峰形完全相同，而陰性對(duì)照品溶液在此保留時(shí)間內(nèi)無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密稱取二氫青蒿素對(duì)照品5.5mg，置10mL的棕色容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.55 g/L的二氫青蒿素貯備液。將此貯備液用無(wú)水乙醇半數(shù)稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.275，0.137 5，0.068 75，0.034 375，0.017 187 5，0.008 59，0.004 29 g/L 的待測(cè)溶液，各進(jìn)樣 20 μL，于216 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，以吸收峰面積 A×10－4為縱坐標(biāo)、二氫青蒿素質(zhì)量濃度 C(g/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=535542C－1533.5，r=0.9997(n=7)，線性范圍為 0.002129～2.18 g/L，定量下限為 0.002 129 g/L。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為0.1 g/L的對(duì)照品溶液，依法連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果二氫青蒿素平均峰面積為452 948，RSD=0.4%(n=6)，表明進(jìn)樣精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)的樣品，分別按2.2項(xiàng)下方法制備6份對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，以外標(biāo)法分別計(jì)算含量。結(jié)果二氫青蒿素的 RSD為2.8%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取同一供試品溶液20μL，室溫下放置，分別于 0.5，1，2，4，8，24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果二氫青蒿素的 RSD為0.23%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):分別精密稱取素對(duì)照品 15，1.5，0.045mg，置于10mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，從中取1mL，加入100μL空白脂肪乳，混合均勻后按2.2項(xiàng)下方法操作，分別進(jìn)樣20μL并記錄峰面積，由回歸方程計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。二氫青蒿素、平均回收率為 95.33%，RSD 為 1.40%(n=9)。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密吸取3個(gè)不同批次(111025，111026，111027)的樣品依2.2項(xiàng)下方法稀釋，于216 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，每個(gè)樣品測(cè)定3次。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

由于二氫青蒿素在210 nm波長(zhǎng)處吸收較弱，干擾性強(qiáng)，很難準(zhǔn)確測(cè)量。二氫青蒿素在216 nm波長(zhǎng)處也有較強(qiáng)吸收，且色譜峰分離良好，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm。同時(shí)，由于二氫青蒿素在有機(jī)溶液中是以α異構(gòu)體和β異構(gòu)體兩種構(gòu)型平衡存在，在溶解初期，主要是β異構(gòu)體峰，隨著放置時(shí)間的增加，β異構(gòu)體峰逐漸減少，α異構(gòu)體峰逐漸增大，最后達(dá)到一對(duì)相對(duì)平衡狀態(tài)。因此，在檢測(cè)二氫青蒿素脂肪乳中二氫青蒿素含量時(shí)，將216 nm波長(zhǎng)下α異構(gòu)體峰和β異構(gòu)體峰峰面積之和記錄為峰面積。

查閱有關(guān)文獻(xiàn)，曾考察了甲醇－水(60∶40)、乙腈－水(55∶45)、乙腈－水(60∶40)等不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇－水、乙腈－水(55∶45)時(shí)，α峰與β峰較難分離;流動(dòng)相為乙腈－水(60∶40)時(shí)，α峰與β峰得到滿意分離，故選擇流動(dòng)相為乙腈 －水(60∶40)。

在檢測(cè)樣品中所含藥物的含量時(shí)，需要先將脂肪乳破乳，再進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。因?yàn)槠迫椴煌耆珪?huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，故考察了甲醇、異丙醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等破乳劑的效果:用甲醇破乳時(shí)需要用50倍的甲醇稀釋二氫青蒿素脂肪乳樣品，使得稀釋完溶液中藥物的含量很低，不利于檢測(cè);用異丙醇、DMSO破乳時(shí)用30倍稀釋后能得到澄清的溶液，但是加入流動(dòng)相會(huì)變渾濁，說(shuō)明破乳仍不完全;用乙醇破乳時(shí)稀釋30倍后溶液變澄清，加入流動(dòng)相時(shí)仍然澄清，說(shuō)明破乳完全，故最終選擇乙醇為破乳劑。

本試驗(yàn)將二氫青蒿素包封于脂肪乳中，將脂肪乳注射液作為一種胃腸外能量補(bǔ)給劑和油溶性藥物遞藥載體[13－14]。一方面，可抑制鐮狀瘧原蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)，抑制惡性瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)的半數(shù)致死量(IC50)值為8.07 g/L;另一方面還可降低維生素E的水平、增加亞麻酸的含量，從而增強(qiáng)抗瘧作用[15－19]。同時(shí)，它能為瘧疾患者提供營(yíng)養(yǎng)，改善營(yíng)養(yǎng)不良患者的淋巴細(xì)胞活性，有助于患者抵抗瘧疾和康復(fù)。本試驗(yàn)中建立了反相高效液相色譜法測(cè)定O/W型二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素的含量，回收率與精密度高，重現(xiàn)性好，可用于二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素含量的測(cè)定。

表1 二氫青蒿素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量的%，n=3)

[1]蔡瑾瑾，祝 琳，晁若冰.TLC檢查雙氫青蒿素中的有關(guān)物質(zhì)[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21(3):304 － 305.

[2]吳鴻揚(yáng).青蒿的藥用價(jià)值與展望[J].藥物與臨床，2006，8(2):186.

[3]Efferth T，Olbrich A，Bauer R.mRNA expression profiles for the response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate，arteether and artemether[J].Biochem Phamacol，2002，64(4):623.

[4]Disbrow GL，Baege AC，Kierpiec KA，etal.Dihydroartemisinin is cytotoxic to papillomavims－expressing epithelial cells in vitro and in vivo[J].Cancer Res，2005，65(23):10 861.

[5]Lai H，Sasaki T，Singh NP.Targeted treatment of cancer with artemisinin and artemisinin－tagged iron－carrying compounds[J].E.rpertOpin Ther Tayets，2005，9(5):1 007.

[6]相麗欣.雙氫青蒿素研究進(jìn)展[J].廣西輕工業(yè)，2010(3):7－8.

[7]馬玉樊，盧婷利.二氫青蒿素對(duì)人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(12):1 324－1 330.

[8]Franceschinis E，Voinovich D，Grassi M.Self－emulsifying pellets prepared by wet granulation in high－shear mixer:influence of formulation variables and preliminary study on the in vitro absorption[J].International Journalof Pharmaceutics，2005，291(1 － 2):87 － 97.

[9]Abdalla A，Mader K.Preparation and characterization of a self－emulsifying pellet formulation[J].European Journalof Pharmaceuticsand Biopharmaceutics，2007，66(2):220 －226.

[10]Cannon JB.Oral solid dosage forms of lipid－based drug delivery systems[J].Am PharmaceutRev，2005，8:108 － 115.

[11]Tuleu C，Newton M，Rose J.Comparative bioavailability study in dogs ofa self－emulsifying formulation of progesterone presented in a pellet and liquid form compared with an aqueous suspension of progesterone[J].Journalofpharmaceutical sciences，2004，93(6):1 495 － 1 502.

[12]Nazzal S，Khan MA.Controlled release of a self－emulsifying formulation from a tablet dosage form:Stability assessment and optimization of some processing parameters[J].International Journal of Pharmaceutics，2006，315(1－2):110－121.

[13]朱維銘.脂肪乳的進(jìn)展[J].江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2002，6(2):103.

[14]陳亭苑.靜脈脂肪乳劑的應(yīng)用和進(jìn)展[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，1995，2(4):252.

[15]Deharo E，Krugliak M，Baccam D，etal.Antimalarial Properties of Soy－Bean Fat Emulsions.Int.J[J].Parasitology，1995，12(25):1 462.

[16]Levander OA，Ager AL.Malarial parasites and antioxidant nutrients[J].Parasitology，1993，107:106.

[17]Levander OA，Ager AL，Morris VC，etal.Protective effect of ground flaxseed or ethyl linoleate in a vitamin E－deficient diet againstmurine parasite[J].Nutrition Research，1991，11:948.

[18]Kumaratilake LM，Robinson BS，F(xiàn)errante A ＆ Poulos A.Antimalarial properties of n－3 and n－6 polyunsaturated fatty acids:In vitro effects on Plasmodium berghei[J].Journal of Clinical Investigations，1992，89:967.

[19]Krugliak M ＆ Ginsburg H.Studies on the antimalarialmode of action of quinoline－containing drugs:time－dependence and irreversibility of drug actionn，and interactions with compounds that alter the function of the parasite’s food vacuole[J].Life Sciences，1991，49:1 219.