間－尼索地平對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用＊

杜景霞，張永健

(1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北 邢臺(tái) 054000;2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期階段，是指由心源性以外各種肺內(nèi)外致病因素引起的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，是肺部炎癥和通透性增加的綜合征，嚴(yán)重威脅著人類的健康。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變?cè)诩毙苑螕p傷中十分重要[1]，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)菌內(nèi)毒素(lippopolysaccharide，LPS)、細(xì)胞因子、氧自由基等的作用下，其通透性增高，分泌和釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子 α(TNF－α)、白細(xì)胞介素1β(IL－1β)、白細(xì)胞介素 2(IL－2)、白細(xì)胞介素6(IL－6)，以及黏附分子(ICAM －1，ECAM －1，VCAM －1，E －selection)、趨 化 因 子(C3，MCP－1)，使肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致ALI。敗血癥時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素是導(dǎo)致ALI的重要因素之一。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，向動(dòng)物血管內(nèi)注入LPS能引起嚴(yán)重肺內(nèi)炎癥和組織損傷，是ALI體內(nèi)研究的經(jīng)典模型之一。本研究中整體觀察了LPS對(duì)大鼠肺血管通透性的影響，肺泡上皮細(xì)胞Ca2+濃度，肺泡灌洗液中蛋白的變化，TNF－α含量變化等，以探討鈣拮抗劑間－尼索地平對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的ALI是否有保護(hù)作用，為ALI治療提供新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

低溫離心機(jī)(英泰TGL16M);超低溫冰箱(美國MDF－290AT型);丹吉爾數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(山東丹吉爾電子有限公司);電熱真空干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Floustar多功能微板分析儀(德國BMG公司)。大腸桿菌脂多糖(美國Sigma公司);丙二醛(MDA)試劑盒，蛋白測(cè)定試劑盒，TNF－αELISA試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組

取60只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重250～350 g，隨機(jī)分成3組，每組各20只。分組包括生理鹽水組(A組)、模型組(B組)、間－尼索地平組(C組)。

1.3 動(dòng)物模型制備及給藥方法

A組和B組均用羧甲基纖維素鈉灌胃，C組予間－尼索地平2.0mg/kg灌胃，灌胃體積均為每 100 g體重 1.5mL，30min后，B組和C組經(jīng)尾靜脈給予5mg/kg的脂多糖進(jìn)行造模，A組經(jīng)尾靜脈給予等體積的生理鹽水。

1.4 取材及標(biāo)本制備

制備血清:造模后6 h，分別將對(duì)應(yīng)組別大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg進(jìn)行麻醉，打開腹腔，從下腔靜脈取血，靜置30min以上，4℃ 3 000 r/min離心15min，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

支氣管－肺泡灌洗液(BALF):開胸腔結(jié)扎右肺，暴露氣管，行氣管插管，用6mL無菌4℃生理鹽水分3次行左支氣管肺泡灌洗液，回收率超過80%。將BALF以1 000 r/min離心10min，取出上清，上清再以3 000 r/min離心10min，分裝，－80℃ 凍存。

病理切片:取右肺中、上葉用于W/D測(cè)定，右肺下葉用10%中性福爾馬林固定，行病理切片檢查。

肺組織勻漿液制備:每組另外選10只大鼠，取出左肺，用濾紙吸干血液和水分后稱重，剪碎組織，以1∶9比例加入生理鹽水，用細(xì)胞破碎儀在冰浴條件下破碎組織10 s，共3次。將制成的混懸液以4℃、3 000 r/min離心15min，吸取上清分裝，－80℃保存，待用。

肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè):取出各組右肺，檢測(cè)Ca2+濃度。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

病理學(xué)觀察:肉眼觀察肺組織的病理改變，常規(guī)包埋、切片，HE染色，光鏡觀察肺組織。BALF中TNF－α和蛋白含量測(cè)定:?。?0℃ 凍存BALF上清液，室溫水浴快速化凍，按試劑盒操作說明書分別測(cè)定TNF－α和蛋白含量。肺W/D值計(jì)算:取右肺上葉，用濾紙沾干水分及血液，稱重，然后置真空干燥箱中80℃烘烤24 h，稱干重，計(jì)算肺W/D值。肺組織中MDA含量、血清蛋白質(zhì)含量測(cè)定:取－80℃ 凍存肺組織勻漿液上清，室溫水浴快速化凍，按試劑盒操作說明書分別進(jìn)行MDA的測(cè)定，在全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得血清蛋白質(zhì)含量。肺毛細(xì)血管通透指數(shù)(CPI)測(cè)定:CPI=BALF中蛋白含量/血清蛋白質(zhì)含量。肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè):將取出的右肺組織細(xì)胞沉淀用D－Hanks液制成密度為105～106的細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)，活細(xì)胞大于90%)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，測(cè)出標(biāo)本熒光強(qiáng)度 F。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 forWindows軟件包。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用 t檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

B組小鼠肺泡間隔增寬，氣道管腔內(nèi)有大量的中性粒細(xì)胞聚集，可見肺組織水腫，點(diǎn)、片狀出血;C組肺損傷明顯減輕，仍有輕度肺組織水腫、出血。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化

2.2 BALF中 TNF－α和 MDA含量

結(jié)果見表1。造模后(B組和C組)BALF中TNF－α含量顯著升高(P＜0.01)。與 A 組比較，B組BALF中TNF－α，MDA及蛋白質(zhì)含量均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而C組比 B組則顯著下降(P ＜0.05)。

2.3 肺W/D值及CPI

結(jié)果見表1。與A組比較，B組大鼠肺W/D值及CPI明顯增加(P ＜0.01)，而 C 組比 B 組顯著下降(P ＜0.01或 P ＜0.05)。

2.4 肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

見圖2。

3 討論

目前認(rèn)為，脂多糖誘導(dǎo)ALI主要通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、基因表達(dá)、酶活性及功能蛋白含量調(diào)節(jié)等方面起作用。脂多糖可以通過與效應(yīng)細(xì)胞膜上的受體系統(tǒng)(包括多個(gè)蛋白分子，如CD14，TLR4，CXCR4，HSP70，HSPgO 等)相互作用，結(jié)合于單核 － 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞[2]，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生多種趨化因子，引起大量中性粒細(xì)胞在肺微血管內(nèi)聚集，然后與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，釋放脂質(zhì)過氧化物、血小板活化因子、花生四烯酸、蛋白酶等介質(zhì)，造成內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和間質(zhì)成分受損，以致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫[3]。本研究中通過觀察脂多糖致傷后6 h肺W/D值、BALF中TNF－α及MDA值、肺毛細(xì)血管通透指數(shù)、肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度等指標(biāo)，成功地復(fù)制了急性肺損傷模型。

表1 各組大鼠觀察指標(biāo)比較(± s，n=10)

表1 各組大鼠觀察指標(biāo)比較(± s，n=10)

注:與 A 組比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01;與 B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別A組B組C組TNF－α(ng/L)262.6 ±63.7 560.40±121.1■430.5 ±102.3■▲MDA(nmol/mg)5.61±0.59 8.69±1.04■6.24±0.86▲蛋白質(zhì)含量(g/L)0.44 ±0.13 0.96 ±0.24■0.73 ±0.23△CPI 13.27 ±3.2 32.30 ±6.5■19.86 ±7.0□▲W/D 4.23±0.17 4.98±0.30■4.61±0.39△

圖2 各組肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較

Ca2+是維持人體生命活動(dòng)的重要元素，在維持肌肉的收縮性、促進(jìn)糖原和蛋白的轉(zhuǎn)換以及維持血管平滑肌的張力方面起著很重要的作用，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的第二信使和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。金勝威[4]的研究結(jié)果表明，LPS可刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的鈣內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高是產(chǎn)生活性氧的必要條件[5]，升高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+可激活活性氧合成酶和線粒體呼吸鏈的氧自由基形成[6]。ALI時(shí)肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，引起肺泡－毛細(xì)血管膜通透性增加，肺血管內(nèi)與間質(zhì)間隙之間液體交換障礙，導(dǎo)致液體聚集于肺泡和間質(zhì)間隙，發(fā)生肺水腫[7]。

目前認(rèn)為，ALI發(fā)病過程中也有細(xì)胞凋亡的作用。關(guān)于細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，已有研究證明細(xì)胞內(nèi)鈣超載是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中普遍存在的中間介質(zhì)[8]。

鈣拮抗劑可通過阻止鈣離子過度內(nèi)流而防止損傷時(shí)細(xì)胞Ca2+濃度明顯升高，減輕細(xì)胞損傷，同時(shí)通過阻止脂多糖信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響致炎因子及其mRNA的表達(dá)，且通過清除氧自由基和抗氧化作用[9]而減輕體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。在脂多糖作用下，L型慢通道鈣拮抗劑可通過阻斷鈣離子內(nèi)流，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子過載，同時(shí)通過活化MAPK和PYK2信號(hào)通路引起核轉(zhuǎn)移因子(NF－κB，AP－1)移位，減少細(xì)胞凋亡，影響致炎因子及其mRNA的表達(dá)而起到肺保護(hù)作用[10]。

本研究中，間－尼索地平(2.0 mg/kg)對(duì)肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響與肺損傷減輕程度呈正相關(guān)，同時(shí)可見BALF中MDA及TNF－α含量、肺CPI及W/D值顯著降低，組織病理學(xué)檢查亦發(fā)現(xiàn)肺組織損傷程度有所減輕，說明該藥對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷有一定的保護(hù)作用。

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