HS-GC-MS法分析比較十二種西藏紅景天樣品的揮發(fā)性成分*

謝惜媚，陳 彬，劉 嵐，彭 俊，徐愛國(guó)，蔣思萍，陸慧寧

(1.中山大學(xué)測(cè)試中心，廣東廣州 510275;2.西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏自治區(qū)拉薩 850001;3.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州 510275)

紅景天 (Rhodiola)是景天科紅景天屬多年生草本植物，在西藏有32種，具有海拔分布特性，可生長(zhǎng)在3 000～5 600 m的灌叢、石縫及亂石灘等環(huán)境中。該屬植物的大多數(shù)種的根莖可入藥，其中大花紅景天 (Rhodiola crenulata)、柴胡紅景天(Rhodiola bupleuroides)和長(zhǎng)鞭紅景天 (Rhodiola fastigiata)等為藏醫(yī)用藥的主要種屬，均有抗缺氧、抗疲勞的功效，還有治療心血管疾病和肺結(jié)核的功效［1］。臨床上紅景天已開始用于預(yù)防高原反應(yīng)、延緩衰老，治療冠心病、心絞痛、心律失常、抗腫瘤及化療的輔助用藥［2］，崔艷梅等［3］對(duì)紅景天屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展作了較系統(tǒng)的綜述，紅景天活性成分主要為紅景天苷、紅景天素及紅景天多糖等。Yang等［4］從大花紅景天根醇溶性部分分離鑒定了37個(gè)化合物，其中包含在紅景天中新發(fā)現(xiàn)的11個(gè)木質(zhì)素及1個(gè)苯丙腈化合物，37個(gè)化合物對(duì)α－葡萄糖苷酶均具有強(qiáng)烈的抑制活性。對(duì)西藏紅景天揮發(fā)油化學(xué)成分研究的相關(guān)報(bào)道主要都采用水蒸汽蒸餾提取、氣質(zhì)聯(lián)用分析法，含量較高的揮發(fā)性成分有香葉醇、正辛醇和芳樟醇等［5－7］，Lei等［8］采用 GC-MS 分析比較了西藏大花紅景天與云南大花紅景天的揮發(fā)油成分，Wang等［9］采用HS-GC-TMS法分析了高山紅景天與圣地紅景天的揮發(fā)性化合物。Ljuba等［10］采用GC-MS分析比較了保加利亞、中國(guó)和印度的三個(gè)薔薇紅景天樣品的揮發(fā)油成分。保加利亞紅景天主要成分是香葉醇其次是桃金娘烯醇;中國(guó)紅景天主要成分是香葉醇，其次是正辛醇;印度紅景天主要成分是苯乙醇，其次是桃金娘烯醇和正辛醇。

目前開發(fā)應(yīng)用最為成熟的是大花紅景天，已有多種藥品和功能性飲品。青藏高原獨(dú)特氣候造成大多數(shù)植物生長(zhǎng)緩慢，某些紅景天種屬的大量采掘?qū)е逻@些品種逐漸面臨瀕危的境地，尋找其他替代品種成為了迫切的工作。本文采集到了西藏不同地區(qū)紅景天的5個(gè)種屬12個(gè)樣品，采用HS-GC-MS的方法對(duì)所采集的紅景天樣品進(jìn)行揮發(fā)性化學(xué)成分及相對(duì)含量進(jìn)行分析，比較了它們成分上的異同以及總離子流圖的相似度。結(jié)合指紋圖譜分析，該方法還可以為紅景天藥材種屬和產(chǎn)地鑒別提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及條件

美國(guó)Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum XLS串聯(lián)四級(jí)桿氣－質(zhì)聯(lián)用儀，帶TriPlus RSH三合一自動(dòng)進(jìn)樣器 (采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣功能)。色譜柱TG－5SILMS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣He，流量1 mL/min;進(jìn)樣針保溫100℃，進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣量 1 mL，分流進(jìn)樣，分流比20∶1;柱起始溫度50℃，保持3min，以5℃/min升至100℃，然后以10℃/min升至200℃，再以20℃/min升至250℃保持1 min;電離方式EI;接口溫度250℃，離子源溫度250℃;電離能70 eV;倍增器電壓800 V;采用Q3MS全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍29～500 amu。標(biāo)準(zhǔn)譜庫為美國(guó)NIST 11譜庫。

1.2 樣品采集、鑒定與處理

樣品采自西藏拉薩、山南、林芝和那曲等地區(qū)9縣。樣品經(jīng)西藏高原生物研究所李暉研究員鑒定，6個(gè)為大花紅景天，2個(gè)為小叢紅景天 (Rhodiola dumulosa)，2個(gè)為長(zhǎng)鞭紅景天，1個(gè)為喜馬紅景天，1個(gè)為柴胡紅景天 (見表1)。樣品切片、陰干，用粉碎機(jī)粉碎，過50目篩，玻璃瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 紅景天樣品Table 1 The Rhodiola amples

1.3 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.3.1 取樣量的選擇 分別稱取樣品 (準(zhǔn)確至1 mg)0.50、1.00、1.50 g于20 mL頂空瓶中，100℃恒溫30 min，間歇自動(dòng)震蕩10 s，停止10 s。各取1.0 mL頂空氣體進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示取樣量1.00 g的總離子流圖各峰形強(qiáng)度及對(duì)稱性為最佳。

1.3.2 平衡時(shí)間及平衡溫度的選擇 各取樣品1.00 g(準(zhǔn)確至1 mg)分別進(jìn)行平衡溫度80、100、120℃平衡時(shí)間10、20、30、40 min的正交實(shí)驗(yàn)，得出平衡時(shí)間30 min、平衡溫度100℃為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.3 參照物及加入量的選擇 首先考慮所選參照物是所測(cè)樣品中不含該成分，且該化合物與所測(cè)揮發(fā)性成分性質(zhì)接近，同時(shí)能夠基線分離。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有檢測(cè)的紅景天樣品中均不含薄荷腦成分，因此選擇了薄荷腦作為參照物。各取1.00 g(準(zhǔn)確至1 mg)樣品分別加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0、5.0、10.0 μL在上述條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在此范圍內(nèi)薄荷腦的加入量與峰面積之間線性關(guān)系良好，R2=0.998。選擇1.00 g樣品加入3.0 μL上述參照物溶液進(jìn)行測(cè)試，能使參照物峰強(qiáng)度落在樣品中各揮發(fā)性成分峰的強(qiáng)度之間。

1.3.4 樣品測(cè)試條件 取紅景天樣品約1.00 g置20 mL頂空瓶中，加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0 μL，在100℃震蕩加熱30 min，進(jìn)樣針100℃預(yù)熱，抽取1.0 mL上層氣體，按“1.2.1 儀器及條件”進(jìn)樣。

1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一種大花紅景天樣品1.00 g(準(zhǔn)確至1 mg)6份，每份加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液5.0 μL，分別進(jìn)行測(cè)試分析，計(jì)算該樣品中檢測(cè)到的21個(gè)揮發(fā)性成分與參照物的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。

表2 大花紅景天樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Relative peak areas of different volatile components

從表2結(jié)果可以看出，同一樣品進(jìn)行6個(gè)平行樣測(cè)試，21個(gè)揮發(fā)性成分與參照物的相對(duì)峰面積的RSD＜8.5%(n=6)，由此可見本方法用于紅景天樣品中微量的揮發(fā)性成分測(cè)定是可行的。

2 樣品測(cè)試與結(jié)果討論

2.1 樣品測(cè)試

按照取樣品1.00 g(準(zhǔn)確至1 mg)于20 mL頂空瓶中，加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0 μL，100℃平衡30 min，抽取上層氣體1.0 mL頂空進(jìn)樣的測(cè)試條件，分別對(duì)12種紅景天樣品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品各進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，各種紅景天典型的總離子流圖見圖1;12種樣品共檢出30個(gè)組分 (表3中序號(hào)為27的成分是內(nèi)標(biāo)物)，檢索結(jié)果見表3;計(jì)算樣品中各組分與參照物薄荷腦的相對(duì)峰面積，2次平行測(cè)試結(jié)果取平均值見表4;用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2004A版)計(jì)算各樣品與6號(hào)樣品譜圖的相似度見表5。

圖1 12種紅景天揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile composition from twelve Rhodiolas

2.2 結(jié)果討論

2.2.1 成分定性和相對(duì)量比較 表3列出了12個(gè)樣品所含共30個(gè)揮發(fā)性成分的定性鑒定結(jié)果。大花紅景天含其中的25個(gè)成分，含量較高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮和傘花烴等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用水蒸汽蒸餾法提取的西藏大花紅景天主要揮發(fā)性成分為香葉醇、正辛醇和芳樟醇等。本實(shí)驗(yàn)采用直接頂空法測(cè)定的大花紅景天主要成分為正辛醇及芳樟醇，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。由于頂空平衡溫度相對(duì)較低，高沸點(diǎn)的香葉醇測(cè)定結(jié)果比水蒸汽蒸餾法偏低。長(zhǎng)鞭紅景天含其中24個(gè)成分，含量較高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮、傘花烴和香葉醇等，與大花紅景天比較接近，不同的是該品種含有反式－松香芹醇。小從紅景天含有13個(gè)揮發(fā)性成分，含量較高的成分是正辛醇和甲基庚烯酮，還含有大花紅景天所沒有的苯乙醇。喜馬紅景天含有其中12個(gè)成分，含量較高的成分是苯乙醇 (相對(duì)峰面積0.35，占該樣品揮發(fā)性成分相對(duì)含量31.4%)，大花紅景天及長(zhǎng)鞭紅景天均不含有該成分。柴胡紅景天僅含6個(gè)揮發(fā)性成分，主要揮發(fā)性成分則是β－蒎烯 (相對(duì)峰面積1.39，占該樣品揮發(fā)性成分相對(duì)含量75.4%)。

表3 紅景天揮發(fā)性成分檢索結(jié)果Table 3 Chemical components of volatile composition from Rhodiolas

表4 紅景天揮發(fā)性成分相對(duì)含量 (以與內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積表示)Table 4 Relative contents of volatile composition from Rhodiolas(represent by the relative peak area with internal standard)

在表4中，用添加的參照物薄荷腦 (保留時(shí)間15.09 min)的峰面積校準(zhǔn)各成分在不同樣品中的相對(duì)含量，使表4的數(shù)據(jù)間具備可比性。

統(tǒng)計(jì)表4數(shù)據(jù)，樣品1至12的揮發(fā)物總量(相對(duì)峰面積總和)依次為:10.9，6.1，6.5，6.8，5.9， 12.6，3.4， 10.3，1.5， 2.0， 1.1、1.8。可以看出，樣品9、10、11、12的總揮發(fā)物含量與其他樣品相比偏少。

以上定性和定量結(jié)果表明，長(zhǎng)鞭紅景天揮發(fā)性成分及含量與大花紅景天較接近，而小叢紅景天、喜馬紅景天和柴胡紅景天與大花紅景天相比差異較大。

2.2.2 TIC譜圖的相似度比較 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以峰較多的6號(hào)大花紅景天樣品為參照，對(duì)其它11種紅景天樣品的TIC圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果列于表5。由表5可見:采自不同地區(qū)的大花紅景天樣品相似度較高，基本都在0.9以上 (其中2號(hào)樣品的相似度偏低，樣品中氧化芳樟醇含量比芳樟醇高，這可能與樣品處理過和保存過程的偶然因素有關(guān)，原因有待考證)。樣品7、8是同地區(qū)不同季節(jié)采集的兩個(gè)長(zhǎng)鞭紅景天樣品，它們與6號(hào)大花紅景天譜圖相似度分別是0.831和0.870，在所分析的5個(gè)紅景天品種中，長(zhǎng)鞭紅景天與大花紅景天的相似度最高。將兩個(gè)長(zhǎng)鞭紅景天進(jìn)行對(duì)比，相似度為0.856，顯示由于采集季節(jié)不同，揮發(fā)性成分存在一定差異。樣品9、10是不同季節(jié)采自不同地區(qū)的小叢紅景天，與6號(hào)大花紅景天譜圖相似度分別是0.623和0.655，差異比較大，同樣對(duì)兩個(gè)小叢紅景天樣品的TIC譜圖比較，相似度為0.710，顯示由于采集季節(jié)和地區(qū)不同，樣品間差異較大。樣品11是喜馬紅景天，樣品12是柴胡紅景天。它們與6號(hào)大花紅景天相比，其相似度分別為0.483和0.433，存在很大差異。

表5 各樣品與6號(hào)樣品TIC譜圖的相似度Table 5 The TIC similarity between 6 and other samples

以上分析得到初步結(jié)論:紅景天的TIC譜圖相似度與品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地相關(guān)。其中相同品種、相同采樣季節(jié)、不同產(chǎn)地間差異較小 (如5個(gè)大花紅景天間相似度在0.9以上)。品種間差異較大 (5個(gè)種屬相似度在0.8～0.4之間);同品種、同產(chǎn)地不同采樣季節(jié)也存在一定差異 (如7、8的相似度約為0.85);同品種、不同產(chǎn)地不同采樣季節(jié)的差異進(jìn)一步擴(kuò)大 (如9、10間的相似度約為0.7，基本符合產(chǎn)地和季節(jié)兩個(gè)因素的疊加)。由此得到結(jié)論:相似度受品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地三個(gè)因素的影響程度依次降低。

成分定性和相對(duì)量分析結(jié)果與色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相當(dāng)一致。前者從化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度解析每個(gè)揮發(fā)性成分，作為基礎(chǔ)研究是必不可少的。后者從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度評(píng)價(jià)樣品之間的相似程度更為系統(tǒng)和科學(xué)。兩者相結(jié)合，更有利于對(duì)不同種屬、采集季節(jié)和產(chǎn)地的紅景天進(jìn)行全面地鑒別和評(píng)估。

［1］倪志誠(chéng).西藏經(jīng)濟(jì)植物志［M］.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1990:250－262.

［2］鄭虹，馬軍杰.紅景天適應(yīng)原樣作用的研究進(jìn)展［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(3):62－64.

［3］崔艷梅，婁安如，趙長(zhǎng)琦.紅景天屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，44(3):328－333.

［4］YANG Yanan，LIU Zhaozhen，F(xiàn)ENG Ziming，et al.Lignans from the root ofRhodiola crenulata［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60:964－972.

［5］黃榮清，吳德雨，駱傳環(huán)，等.氣相色譜－質(zhì)譜法分析西藏紅景天揮發(fā)油成分［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(8):693－694.

［6］韓泳平，陳胡蘭，宋學(xué)偉，等.藏藥大花紅景天揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜－質(zhì)譜分析［J］.華西藥學(xué)雜志，2005，20(2):104－106.

［7］韓泳平，宋學(xué)偉，李遠(yuǎn)森，等.大花紅景天揮發(fā)性提取物制備方法比較研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(13):973－974.

［8］LEI Yidong，NAN Peng，TSERING Tashi，et al.Interpopulation variability of rhizome essential oils inRhodiola crenulatafrom Tibet and Yunnan，China［J］.Biochemical Systematics Ecololgy，2004，32(6):611－614.

［9］WANG Haoyang，GUO Yinlong.Rapid analysis of the volatile compounds in the rhizomes ofRhodiola sachalinensisandRhodiola sacraby static headspace-gas chromatography– tandem mass spectrometry［J］.Analytical Letters，2004，37(10):2151–2161.

［10］LJUBA Evstatieva，MILKA Todorova，DANIELA Antonova，et al.Chemical composition of the essential oils ofRhodiola roseaL.of three different origins［J］.Pharmacognosy Magazine，2010，6(24):256－258.