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    大孔樹(shù)脂純化五味子總木脂素、總?cè)乒に囇芯?/h1>
    2013-09-14 08:47:52莫永俊汪春泉趙曉宏
    關(guān)鍵詞:脂素樣液三萜

    莫永俊 汪春泉 王 琦 趙曉宏

    1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心,吉林長(zhǎng)春 130118;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所,北京100193

    五味子 Schisandra chinensis(Turcz.)Baill 為著名中藥,具有益氣生津、斂肺滋腎、止瀉、安神等功效,其主要活性成分為總木脂素和總?cè)啤,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,五味子總木脂素具有保護(hù)心肌、降血壓、降血脂等功效[2],三萜類物質(zhì)具有抗病毒、抗腫瘤等功效[3-4]。大孔樹(shù)脂具有交換速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn),對(duì)各類中藥有效組分以及中藥復(fù)方有效部位的精制純化發(fā)揮了重要的作用[5-6]。本文旨在應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂同時(shí)純化五味子中總木脂素總?cè)?,以?shù)脂對(duì)總木脂素的吸附解析性能為主要考察指標(biāo),兼顧總?cè)频奈浇馕雎?,篩選適宜的大孔樹(shù)脂類型,確定最佳的純化工藝。本文首次采用梯度洗脫法同時(shí)純化五味子總木脂素總?cè)疲K產(chǎn)品中有效物質(zhì)含量顯著提高,為高純度五味子總木脂素總?cè)频墓I(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

    1 儀器與試藥

    W-2102 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司);Waters 高效液相色譜系統(tǒng)(Waters2489 紫外檢測(cè)器,Waters2707 自動(dòng)進(jìn)樣器,Waters Empower 3 工作站)。

    五味子藥材(產(chǎn)地為吉林省白山市,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所趙曉宏副研究員鑒定);五味子醇甲(中國(guó)藥品生物制品鑒定所,批號(hào):110857-201010);齊墩果酸(中國(guó)藥品生物制品鑒定所,批號(hào):110709-200505);D-101、D-201、AB-8、ADS-7、S-8 型大孔吸附樹(shù)脂(購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司);甲醇乙醇分析純(北京化工廠);甲醇色譜純(Burdick&Jackson公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 含量測(cè)定[1]

    2.1.1 五味子總木脂素含量測(cè)定

    精密稱取五味子醇甲0.515 mg,置于10 mL 容量瓶中,甲醇定容,搖勻即得。精密量取對(duì)照品溶液100、150、200、250、300、350 μL,分別加甲醇定容至 10 mL,在 250 nm處測(cè)定吸光度,以五味子醇甲濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=115.14X+0.023 4,r=0.999 6,五味子醇甲在 0.021~0.072 mg 有良好的線性關(guān)系。

    2.1.2 五味子總?cè)坪繙y(cè)定

    精密稱取齊墩果酸4.760 mg,置于25 mL 容量瓶中,甲醇定容,搖勻即得。精密量取對(duì)照品溶液100、200、300、400、500、600 μL 揮干溶劑,加 0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液,0.8 mL 高氯酸,搖勻后60℃水浴15 min,冷卻至室溫,加入5 mL 冰醋酸搖勻,于546 nm 處測(cè)定吸光度,以齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=7.972 7X-0.030 5,r=0.999 2,齊墩果酸在19.040~114.240 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.1.3 五味子醇甲含量測(cè)定

    2.1.3.1 色譜條件 色譜柱為Cyncromis C18 柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35,檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm,流速為1 mL/min,柱溫為室溫。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

    2.1.3.2 含量測(cè)定 精密稱取五味子醇甲對(duì)照品4.39 mg 置于25 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,搖勻即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL,注入高效液相色譜儀,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到線性回歸方程Y=5×106X-155678,r=0.999 5,五味子醇甲在 0.702~2.118 μg 線性關(guān)系良好。

    2.2 五味子上樣液的制備

    五味子藥材粉碎,加入10倍量的95%乙醇,加熱回流3次,每次2 h,將醇提液冷卻后過(guò)濾,回收乙醇,濃縮得到五味子乙醇提取浸膏,加適量的水稀釋即得五味子上樣液(五味子乙醇提取浸膏中總木脂素、總?cè)?、五味子醇甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.80%、3.76%、0.75%)。

    2.3 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)篩選

    2.3.1 靜態(tài)吸附性能考察

    分別精密稱取不同類型已預(yù)處理的樹(shù)脂各2 g,置于250 mL 具塞錐形瓶中,加入40 mL 五味子上樣液(總木脂素濃度為 1.0 mg/mL),25℃恒溫條件下振蕩 24 h(100 r/min),充分吸附后,過(guò)濾,將濾液(吸附液)蒸干,測(cè)定其總木脂素、總?cè)?、五味子醇甲含量,?jì)算比吸附量,結(jié)果見(jiàn)表1。

    2.3.2 靜態(tài)解析性能考察

    取過(guò)濾后的樹(shù)脂,加蒸餾水100 mL,25℃恒溫振蕩2 h(100 r/min),過(guò)濾后的樹(shù)脂中加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,25℃恒溫振蕩 24 h(100 r/min),過(guò)濾,將水洗濾液和醇洗濾液合并蒸干,測(cè)定濾液(解析液)中總木脂素、總?cè)?、五味子醇甲含量,?jì)算解析率,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 5種類型大孔樹(shù)脂的吸附和解吸性能

    由表1 結(jié)果可知,與其他類型的樹(shù)脂相比,AB-8型樹(shù)脂對(duì)總木脂素、總?cè)?、五味子醇甲的吸附解析性能最好,故選擇AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

    2.4 AB-8型大孔樹(shù)脂吸附解析工藝條件優(yōu)化

    2.4.1 上樣液濃度的影響

    稱取10 g AB-8型大孔樹(shù)脂濕法裝入色譜柱(樹(shù)脂柱床體積約 10 mL),分別制備濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL(以總木脂素的含量計(jì),均為175.00 mg)的五味子上樣液,以1BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附,收集流出液,水浴蒸干后測(cè)定總木脂素、總?cè)频暮?,?jì)算比吸附量,結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 上樣液濃度對(duì)總木脂素總?cè)票任搅康挠绊?/p>

    由圖1 結(jié)果可知當(dāng)上樣液濃度為1.5 mg/mL時(shí),AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)總木脂素的比吸附量最大,為11.79 mg/g;當(dāng)上樣液濃度分別為0.5、1.5 mg/mL時(shí),對(duì)總?cè)票任搅孔畲螅謩e為7.97、7.44 mg/g。以樹(shù)脂對(duì)總木脂素的吸附解析性能為主要考察指標(biāo),兼顧總?cè)频奈浇馕雎?,最終確定1.5 mg/mL 為最佳上樣液濃度。

    2.4.2 最大上樣量的考察

    將110 mL 五味子上樣液(總木脂素濃度為1.5 mg/mL),以1BV/h的流速通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱(10.0 g)進(jìn)行吸附,分段收集流出液,每10 毫升一份,共接取11份,水浴蒸干測(cè)定其有效物質(zhì)的含量。以流出液體積為橫坐標(biāo),流出液中有效物質(zhì)濃度為縱坐標(biāo),繪制泄露曲線見(jiàn)圖2。

    圖2 泄漏曲線

    由圖2 泄漏曲線可知,上柱流出液達(dá)到7BV時(shí),流出液中總木脂素濃度約為上樣液濃度(1.5 mg/mL)的10%,說(shuō)明總木脂素開(kāi)始泄漏,上柱液為4BV時(shí),總?cè)崎_(kāi)始泄漏;以總木脂素為主要考察指標(biāo),最終確定最大上樣量為70 mL。

    2.4.3 水洗量的考察[10]

    由于蒸餾水對(duì)木脂素和三萜的洗脫能力很弱,用蒸餾水洗滌可除去糖類等水溶性雜質(zhì)。配制70 mL 五味子上樣液(總木脂素濃度為1.5 mg/mL),以1BV/h的流速通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱(10.0 g),然后用蒸餾水以1BV/h的流速進(jìn)行洗脫,分段收集過(guò)柱流出液,每10 毫升收集1份共15份。用Molish 反應(yīng)檢測(cè)糖的反應(yīng)是否為陰性,9BV時(shí)Molish 反應(yīng)為陰性,故確定蒸餾水的體積為9BV。

    2.4.4 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)的考察[11]

    配制70 mL 五味子上樣液(總木脂素濃度為1.5 mg/mL),以1BV/h的流速通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱(10.0 g),吸附完全后,用90 mL 蒸餾水以1BV/h的流速進(jìn)行洗脫,然后分別用10BV的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇連續(xù)洗脫,洗脫流速為1BV/h,測(cè)定各個(gè)梯度洗脫液有效物質(zhì)的含量,結(jié)果見(jiàn)圖3、4。

    圖3 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)有效物質(zhì)含量的影響

    圖4 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)有效物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

    由圖3、4 結(jié)果可知用10%、20%、30%等低濃度乙醇洗脫所得組份中總木脂素和總?cè)频馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,由90%,95%等高濃度乙醇洗脫所得組份中總木脂素和總?cè)频馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)也較低。綜合考慮終產(chǎn)品中總木脂素和總?cè)频暮亢唾|(zhì)量分?jǐn)?shù),首先采用30%乙醇洗脫除去雜質(zhì)含量高組份,然后用80%乙醇洗脫得到有效物質(zhì)含量高的組分。

    2.4.5 洗脫溶劑用量的確定

    將70 mL 五味子上樣液(總木脂素濃度為1.5 mg/mL),以1BV/h的流速進(jìn)行上柱,通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱(10.0 g),90 mL 蒸餾水以1BV/h的流速洗脫樹(shù)脂柱,30%乙醇洗脫樹(shù)脂柱,流速為1BV/h,分段收集洗脫液,每10 毫升收集1份,共10份;然后用80%乙醇洗脫樹(shù)脂柱,流速為1BV/h,分段收集洗脫液,每10 毫升收集1份,共12份,水浴蒸干流出液,測(cè)定其總木脂素和總?cè)频暮浚Y(jié)果見(jiàn)圖5、6。

    由圖5 結(jié)果表明當(dāng)30%乙醇洗脫用量為9BV時(shí),累積固形物的質(zhì)量已達(dá)到總流出液固形物質(zhì)量的99%;圖6 結(jié)果表明當(dāng)80%乙醇洗脫用量為10BV時(shí),可將98%以上的有效物質(zhì)含量高的組分洗脫下來(lái),綜合考慮有效物質(zhì)的洗脫率、洗脫溶劑用量、洗脫時(shí)間等因素,最終選擇30%乙醇洗脫用量為9BV,80%乙醇洗脫用量為100 mL。

    2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

    圖5 低濃度乙醇洗脫曲線

    圖6 高濃度乙醇洗脫曲線

    按照上述確定的純化五味子總木脂素總?cè)频墓に囍苽? 批樣品,測(cè)定其中總木脂素、總?cè)?、五味子醇甲的含量? 批樣品中總木脂素含量分別為39.67%、39.59%、39.36%,平均值為39.55%;總?cè)频暮糠謩e為14.09%、13.84%、13.94%,平均值為13.96%;五味子醇甲含量分別為9.05%、8.89%、8.92%,平均值為8.95%;三者含量均顯著提高,分別提高了6.8、3.7、11.9倍。經(jīng)過(guò)一系列考察可知應(yīng)用大孔樹(shù)脂純化五味子總木脂總?cè)频墓に嚭侠怼⒖尚?,重現(xiàn)性較好。

    3 討論

    應(yīng)用大孔樹(shù)脂同時(shí)純化五味子總木脂素和總?cè)频难芯课匆?jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)5 種不同類型的大孔樹(shù)脂吸附解析性能考察,發(fā)現(xiàn)AB-8型大孔樹(shù)脂最適合五味子總木脂素總?cè)频木萍兓?。通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)對(duì)各個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行考察,最終確定AB-8型樹(shù)脂最佳工藝條件。

    本文首次采用梯度洗脫法同時(shí)純化五味子總木脂素總?cè)?,首先用低濃度乙醇洗脫?shù)脂柱以除去雜質(zhì)含量高的組分,然后用高濃度乙醇洗脫樹(shù)脂柱以獲得有效物質(zhì)含量高的組分。經(jīng)過(guò)純化后終產(chǎn)品中有效物質(zhì)的含量顯著提高,總木脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由5.80%提高到39.55%,總?cè)频馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)由3.76%提高到13.96%,五味子醇甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.75%提高到8.95%,分別提高了6.8、3.7、11.9倍。

    目前應(yīng)用大孔樹(shù)脂分離純化五味子所得的終產(chǎn)品中有效物質(zhì)的含量較低,因此患者服藥量較大,并且過(guò)多的非有效成分可能會(huì)產(chǎn)生毒副作用。本文采用梯度洗脫法同時(shí)純化五味子總木脂素和總?cè)疲瑸楦呒兌任逦蹲佑行ЫM分的生產(chǎn)提供了理論依據(jù),對(duì)傳統(tǒng)中藥五味子的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

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