四年生鮮人參遺傳毒性及大鼠長期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

楊 銘 于德偉 林 賀 陳文學(xué) 楊 明

1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117

人參是五加科植物人參（Panax Ginseng C．A．Meyer）的根，其新鮮根稱為鮮人參或水參，鮮人參可被加工成為生曬參、紅參、糖參、保鮮參、活性參、大力參等[1]。本文根據(jù)《新資源食品安全評(píng)價(jià)規(guī)程》、《GB 15193.1-2003 食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》的規(guī)程要求，對(duì)四年生鮮人參進(jìn)行毒理學(xué)安全性初步研究，提供其食用的安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品

四年生鮮人參（含水量67.19%）產(chǎn)于吉林集安，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院左家特產(chǎn)研究所提供，實(shí)驗(yàn)前粉碎以蒸餾水配制不同濃度給藥。

1.2 動(dòng)物

Wistar 大鼠，清潔級(jí)，體重 130～140 g，雌雄各半；昆明種小鼠，體重18～22 g，雌雄各半或雄性。均購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉）-2003-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度18～22℃，濕度50%～70%。

1.3 菌株

TA97、TA98、TA100、TA102 均購自華西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院檢測中心。

1.4 儀器

動(dòng)物血液分析儀，型號(hào)：HEMAVET950，美國產(chǎn)品；OLYMPUS 顯微鏡，型號(hào)CH-20，日本產(chǎn)品；電解質(zhì)分析儀，型號(hào)：E-555，南京產(chǎn)品；單通道血凝儀，型號(hào)：BT-M1，德國產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀，型號(hào)：ALCYON-300，美國雅培公司產(chǎn)品。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法[2-4]

1.5.1 急性毒性試驗(yàn) 取Wistar 大鼠40 只，雌雄各半，體重130～140 g，根據(jù)體重隨機(jī)均分兩組（對(duì)照組及四年生鮮人參組），禁食16 h，于24 h 內(nèi)灌胃給藥四年生鮮人參3次，累計(jì)給藥量18.6 g/kg 體重，對(duì)照組大鼠灌胃等體積蒸餾水。給藥后立刻對(duì)大鼠的外觀體征、行為、活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、體重、糞便、腺體分泌，以及有無其他中毒癥狀和死亡等情況進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察14 d。

1.5.2 Ames 試驗(yàn) 四年生鮮人參受試品設(shè)4000、1000、200、40、8μg/皿，共 5 組；另設(shè)溶劑對(duì)照組（蒸餾水）、S9 對(duì)照組（10%S9 混合液）；陽性對(duì)照組分別為敵克松（Dexon，50 μg/皿）、絲 裂 霉 素 C（MMC，20 μg/皿 ）、疊 氮 鈉 （NaN3，20 μg/皿 ）、1.8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）和 2-氨基芴（2-AF，20 μg/皿）。采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)箱孵育48 h，計(jì)算回變菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)在同條件下3個(gè)平行樣重復(fù)2次。

1.5.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 取18～20 g 小鼠，雌雄各半。四年生鮮人參受試品設(shè)4.0、2.0、1.0 g/kg 體重3個(gè)劑量組，溶劑對(duì)照為蒸餾水，陽性對(duì)照為環(huán)磷酰胺 （40 mg/kg 體重），小鼠灌胃給藥2次（環(huán)磷酰胺組為1次），間隔24 h，末次給藥后6 h（環(huán)磷酰胺組為24 h）頸椎脫臼處死動(dòng)物，取股骨骨髓細(xì)胞加小牛血清混勻后推片，甲醛固定，吉姆薩染色晾干。觀察計(jì)數(shù)：每只鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE），觀察含微核（MN）的 PCE 數(shù)（1個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)微核，但都按1個(gè)細(xì)胞計(jì)），計(jì)算其微核出現(xiàn)率（MNF），以‰表示。并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE/正染紅細(xì)胞（NCE）的比值。

1.5.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 雄性小鼠20～22 g，按體重均分5組，每組5 只。分別為四年生鮮人參4.0、2.0、1.0 g/kg 體重劑量組，環(huán)磷酰胺組（60 mg/kg 體重），蒸餾水組。每日灌胃給藥1次，連續(xù)5 d。于首次給藥后第35日頸椎脫臼處死動(dòng)物，取精子，涂片、固定、染色、鏡檢。

1.5.5 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn) 取Wistar 大鼠80 只，根據(jù)體重隨機(jī)均分四組，每組動(dòng)物20 只，雌雄各半。分別為正常對(duì)照組，四年生鮮人參8.0、4.0、2.0 g/kg 體重劑量組，大鼠于每日上午8 時(shí)和下午4 時(shí)各灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。停藥后，觀察2周恢復(fù)期。試驗(yàn)期間觀察大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)，同時(shí)稱量大鼠體重、攝食量、飲水量，測量體溫。分別于給藥30 d 和2周恢復(fù)期結(jié)束后，各組處死10 只動(dòng)物，雌雄各半。大鼠禁食12 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血液學(xué)[包括紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）、血細(xì)胞比容（HCT）、紅細(xì)胞平均容量（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）、白細(xì)胞（WBC）、白細(xì)胞分類（G、L、M）、凝血酶原時(shí)間（PT）、部分凝血活酶時(shí)間 （APTT）]和血液生化學(xué) [谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素（Urea）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷胺酸（GLU）、總膽紅素（TBIL）、膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）]檢測，同時(shí)肉眼觀察主要臟器的外觀形態(tài)、表面色澤、輪廓體積、所處位置是否正常，摘取主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢）稱量重量計(jì)算臟器系數(shù)，并同胰腺、骨髓、膀胱、淋巴結(jié)、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、前列腺、視神經(jīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用 χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

四年生鮮人參供試品以最大給藥濃度和給藥體積灌胃給予大鼠，觀察14 d 內(nèi)大鼠狀態(tài)。可見動(dòng)物行為活動(dòng)正常，被毛光澤、糞便、飲食、體重增長等指標(biāo)均正常，未出現(xiàn)其它明顯中毒癥狀和死亡。觀察14 d 后處死動(dòng)物尸解，主要臟器未見外觀形態(tài)、表面色澤、輪廓體積、所處位置等出現(xiàn)異常。表明四年生鮮人參大鼠的最大耐受劑量大于18.6 g/kg 體重，在此劑量下無急性毒性作用。

2.2 Ames 試驗(yàn)

四年生鮮人參供試品對(duì) TA97、TA98、TA100、TA102 標(biāo)準(zhǔn)菌株，在有無S9 混合液條件下均未引起基因組堿基置換或移碼突變，于自發(fā)回變組相同（P>0.05），而與陽性對(duì)照組比較，差異則均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明四年生鮮人參Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陰性。見表1。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

四年生鮮人參4.0、2.0、1.0 g/kg 體重3個(gè)劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率同陰性對(duì)照組相同（P>0.05），而與陽性對(duì)照組比較，差異則有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明四年生鮮人參對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無誘發(fā)微核作用。見表2。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

四年生鮮人參4.0、2.0、1.0 g/kg 體重3個(gè)劑量組出現(xiàn)小鼠精子畸形率和陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與陽性對(duì)照藥比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明四年生鮮人參未引起小鼠精子明顯畸形。見表3。

2.5 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.5.1 對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響 大鼠連續(xù)灌胃給予四年生鮮人參30 d 及停藥觀察2周，給藥各組動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，飲食、糞便正常。與對(duì)照組動(dòng)物比較無異常改變。

表1-1 四年生鮮人參供試品的Ames 試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

表1-1 四年生鮮人參供試品的Ames 試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

注：“-”代表無數(shù)據(jù)

組別 劑量（μg/皿）TA97－S9（cfu） +S9（cfu）TA98－S9（cfu） +S9（cfu）四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參敵克松2-氨基芴溶劑對(duì)照S9 對(duì)照自發(fā)回變4000 1000 200 40 8 50 20蒸餾水10%S9 混合液-116.7±3.8 115.3±5.4 114.3±11.4 112.3±8.6 116.3±8.2 1360.5±198.2-123.0±9.1-136.5±7.8 131.5±16.2 123.2±11.3 130.3±14.0 124.5±10.4-923.3±49.8 127.0±14.6 130.2±11.3 31.5±1.7 33.2±3.0 28.8±4.7 33.5±4.0 35.5±5.0 241.0±9.4-37.7±2.4-33.8±2.1 37.2±2.1 36.3±3.8 36.0±2.5 37.5±4.5-1479.7±71.8 40.2±1.9 38.8±1.8 121.8±6.5 35.5±1.8

表1-2 四年生鮮人參供試品的Ames 試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

表1-2 四年生鮮人參供試品的Ames 試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

注：“-”代表無數(shù)據(jù)

組別 劑量（μg/皿）TA100－S9（cfu） +S9（cfu）TA102－S9（cfu） +S9（cfu）四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參疊氮鈉2-氨基芴絲裂霉素C 1.8-二羥基蒽醌溶劑對(duì)照S9 對(duì)照自發(fā)回變4000 1000 200 40 8 20 20 20 50蒸餾水10%S9 混合液-143.0±9.3 131.8±4.0 133.5±9.2 140.2±9.2 140.0±8.9 2261.3±247.3 233.7±7.2 220.2±4.1 225.7±9.9 218.2±10.8 225.3±3.3 239.8±3.9 230.2±9.8 231.7±6.8 238.2±7.0 238.7±10.2---160.3±12.1 140.3±4.5 140.2±8.9 146.2±11.0 166.5±22.5-2933.2±64.4-------153.7±8.8-170.8±13.4 162.0±6.7 1340.5±55.6-231.5±7.5-879.0±21.7 238.3±5.9 234.0±6.1 165.8±12.9 226.7±12.2

表2 四年生鮮人參對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響（±s）

表2 四年生鮮人參對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01；PCE：多染紅細(xì)胞；NCE：正染紅細(xì)胞

表四年生鮮人參對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響（組別 劑量（g/kg）小鼠♀/♂PCE♀/♂MN♀/♂MNF（‰）♀/♂PCE/NCE陰性對(duì)照組（蒸餾水）四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參環(huán)磷酰胺（mg/kg 體重）-4.0 2.0 1.0 40 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5000/5000 5000/5000 5000/5000 5000/5000 5000/5000 12/13 14/16 12/13 9/14 56/57 2.4±1.1/2.6±1.1 2.8±0.8/3.2±0.8 2.4±0.5/2.6±0.8 1.8±0.8/2.8±1.3 11.2±1.1*/11.4±3.5*1.026±0.137 1.069±0.123 1.022±0.158 0.922±0.062 0.886±0.038

表3 四年生鮮人參對(duì)小鼠精子發(fā)生率的影響（±s）

表3 四年生鮮人參對(duì)小鼠精子發(fā)生率的影響（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

組別 劑量（g/kg）雄性小鼠（只）受檢精子數(shù)（個(gè)）精子畸形數(shù)（個(gè)）精子畸形率（%）陰性對(duì)照組（蒸餾水）四年生鮮人參四年生鮮人參四年生鮮人參環(huán)磷酰胺（mg/kg 體重）-500018.2±3.11.82 4.0 2.0 1.0 60 5 5555 5000 5000 5000 5000 17.2±3.7 18.2±6.3 14.6±5.6 129.2±13.3*1.72 1.82 1.46 12.92

2.5.2 對(duì)大鼠體重、體溫、攝食量及飲水量的影響 連續(xù)灌胃給予四年生鮮人參30 d 及停藥觀察2周，給藥各組大鼠與正常大鼠比較體溫波動(dòng)正常、攝食量、飲水量和體重變化均未見異常。

2.5.3 大鼠血液學(xué)及血液生化學(xué)檢測結(jié)果 連續(xù)灌服四年生鮮人參30 d 和2周恢復(fù)期觀察結(jié)束后，四年生鮮人參各劑量組大鼠的血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比均無明顯差異。

2.5.4 主要臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查結(jié)果 大鼠連續(xù)灌胃給予四年生鮮人參30 d 和停藥觀察2周后，分別處死動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)解剖，可見四年生鮮人參各劑量組動(dòng)物的主要臟器，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢等外觀、形態(tài)、位置正常，表面光滑，色澤正常，體積無腫大和縮小。稱量主要臟器計(jì)算臟器系數(shù)，各給藥組與對(duì)照組比較均無顯著性差異。四年生鮮人參高劑量組和對(duì)照組病理組織學(xué)檢查均未出現(xiàn)病理改變。

3 討論

人參被譽(yù)為“百草之王”，是馳名中外的名貴中藥材。我國是世界上最早應(yīng)用人參并有文字記載的國家。東漢時(shí)期《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，認(rèn)為人參“味甘微寒，主補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、除邪氣、開心益智、久服輕身延年“[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為人參具有廣泛的藥理作用，能加強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)心血管系統(tǒng)有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，還有糾正脂代謝障礙和調(diào)節(jié)血糖等作用。目前我國是世界最大的人參生產(chǎn)國，而在人參作為保健滋補(bǔ)食品使用方面我們卻落后于韓國及東南亞等地。由于在我國對(duì)人參食用安全性存在爭議，認(rèn)為濫用有毒副作用，人參只能用于藥品而不能用于食品。因此，不僅限制了人參生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，同時(shí)也制約了人參保健食品的開發(fā)利用。

近年人參安全性研究顯示人參粉小鼠最大耐受量（MTD）分別為 15.2（雌）、30.5（雄）g/kg 體重，遺傳毒性試驗(yàn)為陰性[6]；以4.0、6.0、8.0 g/kg 體重劑量長期喂食大鼠，對(duì)大鼠血液學(xué)、肝腎功能、電解質(zhì)、脂代謝，未見明顯影響[7-10]。

本文主要針對(duì)四年生鮮人參進(jìn)行毒理安全性研究，其研究結(jié)果表明，四年生鮮人參大鼠最大耐受劑量大于18.6 g/kg體重；小鼠骨髓微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、Ames 試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，提示四年生鮮人參無遺傳毒性；四年生鮮人參大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)，大鼠外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、飲食等一般狀態(tài)觀察結(jié)果正常，攝食、飲水、體重增長情況良好，給藥30 d 和恢復(fù)期結(jié)束血液學(xué)、血液生化學(xué)指標(biāo)正常，尸解、主要臟器系數(shù)及病理學(xué)檢查未見明顯病理改變，表明其無明顯毒性作用。上述試驗(yàn)結(jié)果為四年生鮮人參的食用安全性提供了毒理學(xué)依據(jù)。

[1]趙晉紅.人參的加工炮制及藥理研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)，2012，28（3）：54-55.

[2]衛(wèi)生部.食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法[S].2003.

[3]衛(wèi)生部.新資源食品安全評(píng)價(jià)規(guī)程[S].2007.

[4]國家新藥審評(píng)中心.藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2007.

[5]王知成.淺談人參[J].醫(yī)學(xué)信息，2011，24（10）：208-209.

[6]孫蘭，高峰，吳曉剛，等.人參粉劑安全及遺傳毒性研究[J].職業(yè)與健康，2011，27（22）：2525-2527.

[7]吳曉剛，高峰，張琨，等.吉林人參亞慢性毒性試驗(yàn)中大鼠血液學(xué)變化的研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，13（1）：36-38.

[8]高峰，張琨，宋昕恬，等.長期喂養(yǎng)大鼠人參粉對(duì)其肝腎功能影響研究[J].中國衛(wèi)生工程學(xué)，2011，10（5）：364-368.

[9]谷建君.人參長期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠血清電解質(zhì)的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，24（2）：47-49.

[10]張琨，高峰，張晶，等.長期喂養(yǎng)大鼠人參粉對(duì)其脂代謝影響研究[J].職業(yè)與健康，2011，27（18）：2094-2095.