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      腎素(前體)受體在ox-LDL激活人臍靜脈內皮細胞ERK1/2通路的作用

      2013-09-14 09:25:16胡欣妍
      關鍵詞:奧美沙坦腎素

      胡欣妍

      動脈粥樣硬化類疾病是嚴重威脅人類健康的疾病,目前一 致認為,動脈粥樣硬化的病理本質是動脈內膜的慢性炎癥。動脈粥樣硬化在各種危險因素如病毒、機械損傷、糖尿病等引起內皮細胞損傷或者功能失調,血管內膜產(chǎn)生一種過度的慢性炎性增生反應[1]。血脂異常,尤其氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)是最重要的致動脈粥樣硬化危險因素。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是細胞內一條重要的信號轉導通路,MAPK包括細胞外信號調節(jié)的蛋白激酶(ERK)、c-jun N 端激酶(JNK)/應激激活的蛋白激酶(SAPK)和P38。它們參與多種胞外啟動信號的細胞內轉導過程,具有調節(jié)細胞的生長、分化、凋亡的作用。腎素(前體)受體[(P)RR]是Nguyen等在2 0 0 2年克隆出的,(P)RR表達在各種細胞中,如神經(jīng)細胞、腎小球系膜、單核細胞、心肌和平滑肌細胞[2-7],由350個氨基酸組成,含有1個非糖基化且高度疏水的氨基末端,該區(qū)域與腎素/腎素前體的結合有關,還含有1個由20個氨基酸構成的尾部。本研究旨在觀察ox-LDL對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的ERK1/2信號通路的激活及(P)RR的作用。

      1 材料與方法

      1.1 材料 健康產(chǎn)婦臍帶由大連市婦產(chǎn)醫(yī)院提供。氧化低密度脂蛋白購自Sigma公司;Renin Receptor siRNA購自Santa公司;兔抗 人 p-ERK1/2 抗 體,ERK1/2 抗 體,β-actin購 自 BIOWORLD公司;RNAiso、RT-PCR試劑盒及引物購自TaKaRa公司;羊抗兔辣根過氧化物酶標記IgG二抗購自Invitrogen公司;siRNA Transfection Reagent購自Fermentas公司。

      1.2 方法

      1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng) 無菌采集健康新生兒臍帶,長約20cm,用PBS將其沖洗干凈,向臍靜脈中注入0.1%Ⅱ型膠原酶,收集消化液離心棄上清,收集細胞。當細胞生長至融合狀態(tài)時,加入胰蛋白酶溶液進行傳代,將2代~6代細胞用于實驗。

      1.2.2 實驗分組及檢測指標 不同濃度ox-LDL(0mg/L、25 mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L)與 HUVECs共同作用15min。濃度為100mg/L的ox-LDL不同時間,即0min、15 min、3 0min、6 0min、1 2 0min,用 Western blot方 法 檢 測p-ERK 1/2、ERK 1/2蛋 白 。RNA干 擾 對HUVECs表 達(P)RRmRNA的影響:空白組;RNA干擾組:siRNA分別轉染HUVECs 2 4h、4 8h、7 2h;轉染試劑組:轉染試劑1處理HUVECs2 4h、4 8h、7 2h,用RT-PCR的方法檢測(P)RR mRNA。(P)RR在ox-LDL激活 HUVECs表達ERK1/2通路的作用:空白組;奧美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M);奧美沙坦 (10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL 組;siRNA轉染+奧美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)組;siRNA轉染+奧美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL組;轉染試劑+奧美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL組。用 Western blot方法檢測p-ERK1/2、ERK1/2蛋白。

      1.2.3 RT-PCR方法 提取HUVECs的RNA,逆轉錄合成cDNA(P)RR上游 PCR引物序列:5′-ATTGGCCTATACCAGGAGAG-3′;(P)RR 下 游 PCR 引 物 序 列:5′-TTCCCCATAACGCTTC CCAA-3′。進行PCR擴增:取PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳,然后凝膠成像儀成象。

      1.2.4 蛋白質印跡 提取各組HUVECs總蛋白,在SDS凝膠上電泳,轉入硝酸纖維素膜,加入兔抗人p-ERK1/2、ERK1/2抗體,4℃孵育過夜。充分洗膜后加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記IgG二抗,37℃3h,充分洗膜后,加入ECL反應體系,曝光顯影。

      2 結 果

      2.1 不同濃度ox-LDL對HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影響 25mg/L~150mg/L的ox-LDL均能引起 HUVECsERK1/2信號通路的磷酸化增加,以濃度為100mg/L的ox-LDL作用最強。詳見圖1。

      圖1 不同濃度ox-LDL對HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影響

      2.2 ox-LDL(100mg/L)不同時間對 HUVECs的 ERK1/2通路磷酸化的影響 ox-LDL引起HUVECs的ERK1/2通路磷酸化增加,從5min開始增加,15min達高峰,此后開始下降。詳見圖2。

      圖2 ox-LDL(100mg/L)不同時間對 HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影響

      2.3 siRNA轉染 HUVECs對 HUVECs表達(P)RRm RNA的影響 siRNA轉染HUVECs,可明顯減少HUVECs表達(P)RRm RNA,以72h作用最明顯。詳見圖3。

      圖3 siRNA轉染HUVECs對HUVECs表達(P)RRm RNA的影響

      2.4 RNA干擾(P)RR對HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影響 在用奧美沙坦和PD123319阻斷AT1和AT2受體的情況下,ox-LDL 引 起 HUVECs的 P-ERK1/2增 加,RNA 干 擾(P)RR表達后,可以明顯抑制ox-LDL可引起HUVECs的P-ERK1/2增加,說明(P)RR可以不依賴于血管緊張素Ⅱ,參與激活HUVECs的ERK1/2通路。詳見圖4。

      圖4 RNA干擾(P)RR對HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影響

      3 討 論

      在MAPK家族中,人們發(fā)現(xiàn)得最早、研究得最透徹的是ERK通路。多種刺激因素,如血栓素A2、血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子等都可激活ERK。通過磷酸化激活轉錄因子,將來自細胞外刺激信號傳導至細胞核內,調節(jié)相應基因的表達,與細胞分化、細胞凋亡、組織入侵和轉移有關。P(RR)是腎素、腎素前體的功能性受體,不但能夠與腎素、腎素前體結合,還可介導生物學功能。腎素與(P)RR結合可使腎素的活性增加為游離腎素的4~5倍。腎素前體與(P)RR結合會引起腎素前體分子構象發(fā)生改變而被激活,同時增加了血管緊張素-Ⅰ的產(chǎn)生,并可直接激活細胞內信號轉導通路,如MAP激酶的ERK1/2和P38信號轉導通路、熱休克蛋白27激酶、PI3K-P85[8]等通路,調節(jié)某些基因的表達,進而導致細胞纖維化、生長和重塑。

      本實驗用奧美沙坦和PD123319阻斷血管緊張素Ⅱ的AT1和AT2受體,排除了ox-LDL、腎素、腎素前體通過使血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生增加,進而作用于其受體而發(fā)揮作用。結果發(fā)現(xiàn),siRNA(P)RR轉染 HUVECs72h,可以明顯抑制(P)RRmRNA 的表達。并且抑制了ox-LDL對HUVECs的ERK1/2信號通路的激活。這說明(P)RR參與了ox-LDL激活HUVECs的ERK1/2通路。推測ox-LDL在增加HUVECs表達腎素、腎素前體,進而腎素、腎素前體作用于(P)RR激活 HUVECs的ERK1/2通路。抑制(P)RR的表達,可以有效抑制內皮細胞的ERK1/2同路的激活,這為抑制ox-LDL引起的內皮細胞的ERK1/2通路的激活,提供了一個新的治療方法。

      [1]Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

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      [4]Saris JJ,Garrelds IM,Dekkers DH,etal.Prorenin induces intracellular signaling in cardiomyocyte independently of angiotensinⅡ[J].Hypertension,2006,48:564-571.

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      [6]Zhang J,Noble NA,Border WA,etal.Receptor-dependent prorenin activation and induction of PAI-1expression in vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295:E810-E819.

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