• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      同型半胱氨酸對高糖培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達的影響

      2013-09-14 09:25:16張卓偉張華屏
      關(guān)鍵詞:活性氧半胱氨酸內(nèi)皮細胞

      張卓偉,柳 潔,張華屏

      糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死的主要原因之一,而內(nèi)皮細胞的損傷是血管病變的前提。同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)作為心血管疾病的危險因素,與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。但其具體發(fā)病機制尚未闡明。研究顯示可能與高血壓、血流流變學、血脂紊亂、高血糖等因素有關(guān),而有關(guān)蛋白質(zhì)、氨基酸代謝異常在糖尿病血管并發(fā)癥中作用的研究非常匱乏[1]。因此本研究觀察HCY對體外高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVEC)ECV-304活性氧的釋放和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表達的影響,為臨床早期干預高同型半胱氨酸血癥提供新的理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株購自南京凱基生物合成有限公司;RPMI1640購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。D-L同型半胱氨酸、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。PCR試劑盒購于大連寶生物公司,引物由上海生物公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或進口分裝。

      1.2 方法

      1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 人血管內(nèi)皮細胞株用RPMI1640培養(yǎng),用前加10%滅活胎牛血清。細胞置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育培養(yǎng),0.25%的胰酶消化傳代。分組情況,正常對照組:含RPMI1640培養(yǎng)液。高糖組(HG組):培養(yǎng)液中含終濃度25mmol/L葡萄糖。HCY組:培養(yǎng)液中含終濃度5 mmol/L HCY。高糖+HCY組:培養(yǎng)液中含葡萄糖25mmol/L和 HCY 5mmol/L。

      1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)

      1.2.2.1 上清液收集及檢測 ECV-304以每孔1×106接種到6孔板上,當生長至85%融合時收集上清液。按上述實驗分組方法,在作用12h、24h、48h之后分別收集細胞培養(yǎng)上清液,離心以去除細胞碎片,-20℃保存?zhèn)溆?,用硫代巴比妥酸法檢測MDA,黃嘌呤氧化酶法檢測SOD。

      1.2.2.2 RT-PCR檢測ICAM-1mRNA的表達水平 將ECV-304細胞接種于培養(yǎng)瓶中,隨機分組和處理同上。處理12 h、24h、48h后分別收集各組細胞,Trizol法提取RNA,瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度儀檢測260nm、280nm吸光度并求出A260/A280,結(jié)果是所提RNA值在1.8~2.0,說明純度符合要求。進行cDNA合成,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為PCR模板。PCR擴增引物序列。ICAM-1 長 度 為 555bp,上游引物:5′-CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG-3′,下游引物:5′-GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA-3′;內(nèi)參照 GAPDH 上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反應條件為:94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸2min,共進行35個循環(huán)。擴增完畢后取PCR產(chǎn)物10μL做1.5%的瓊脂凝膠電泳,凝膠圖像分析儀分析,根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因電泳條帶光密度的比值,進行ICAM-1mRNA表達水平的半定量分析。

      1.3 統(tǒng)計學處理 每個實驗均重復3次,每次實驗至少有3個重復值。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,統(tǒng)計學分析用多因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 光鏡下細胞形態(tài)的觀察 正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞形狀為棱形,單層生長,呈典型的鵝卵石樣鑲嵌排列。5mmol/L HCY作用24h后,可見細胞普遍收縮,間隙增大,細胞變小變圓,并有片狀細胞脫失區(qū)。

      2.2 細胞上清液中SOD活力的測定(見表1) HCY組、HG組、HG+HCY組在各時間點SOD活力均低于正常對照組(P<0.01),且HG+HCY組較HG組、HCY組降低的更明顯(P<0.01)。呈時間依賴性關(guān)系。

      表1 ECV304細胞上清液SOD活力變化(±s) U/mL

      表1 ECV304細胞上清液SOD活力變化(±s) U/mL

      組別 n 12h 24h 48h正常對照組 3 24.602±0.446 24.026±0.197 24.038±0.066 HG組 3 22.584±1.3461) 20.145±2.4551) 16.872±1.6961)HCY組 3 21.216±2.3741) 18.665±1.3221) 14.047±6.7521)HG+HCY組3 16.805±1.4411)2) 13.957±5.2241)2) 10.674±9.3981)2)與正常對照組相比,1)P<0.01;與HG組HCY組相比,2)P<0.01

      2.3 細胞上清液 MDA水平的測定(見表2) HG組、HCY組、HG+HCY組各時間點MDA水平均高于正常對照組(P<0.01),且HG+HCY組較HG組、HCY組升高的更明顯(P<0.01)。隨時間延長,MDA水平逐漸升高(P<0.01)。呈時間依賴性關(guān)系。

      表2 ECV304細胞上清液MDA水平變化(±s) nmol/mL

      表2 ECV304細胞上清液MDA水平變化(±s) nmol/mL

      2.4 測定ICAM-1mRNA 的表達(見圖1、表3) ICAM-1 mRNA擴增片段長度為555bp,GAPDH擴增片段長度為452bp,對照組ECV304ICAM-1mRNA呈低表達。HG組、HCY組、HG+HCY組ICAM-1mRNA表達顯著高于同時間點對照組(P<0.01),HG+HCY組ICAM-1mRNA表達較HG組、HCY組增加的更明顯,具有時間依賴性。

      表3 HCY對ECV-304細胞ICAM-1mRNA表達的影響(±s)

      表3 HCY對ECV-304細胞ICAM-1mRNA表達的影響(±s)

      組別 n 12h 24h 48h正常對照組 3 0.63±0.04 0.62±0.03 0.65±0.04 HG組 3 0.81±0.031) 0.92±0.011) 0.98±0.011)HCY組 3 0.90±0.021) 0.98±0.011) 1.07±0.021)HG+HCY組 3 1.05±0.051)2) 1.19±0.041)2) 1.32±0.051)2)與正常對照組相比,1)P<0.01;與HG組、HCY組相比,2)P<0.01

      圖1 HCY對血管內(nèi)皮細胞ICAM-1mRNA表達的影響

      3 討 論

      同型半胱氨酸是一種血管損傷性氨基酸[2-4],是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。它的生理作用是維持體內(nèi)含硫氨基酸的平衡。目前研究表明糖尿病患者HCY水平的增高是血管病變的重要危險因素。高同型半胱氨酸血癥作為心血管疾病的獨立危險因素已經(jīng)得到普遍認同,在最近的一項研究中發(fā)現(xiàn),糖尿病與非糖尿病人群的比較,高同型半胱氨酸血癥是獨立于其他危險因素的與預期5年死亡率相關(guān)的危險因素,而且似乎是最強的危險因素[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)[6]血漿同型半胱氨酸水平升高可加速動脈粥樣硬化,并出現(xiàn)動脈和靜脈血栓形成,從而引起心腦血管疾病及周圍血管疾病。

      HCY致血管病變的機制不是十分清楚,國內(nèi)外對大血管病變的研究認為,HCY的作用可能與血小板激活、平滑肌增生、內(nèi)皮細胞功能失常、脂蛋白氧化和血黏滯度增加有關(guān)[7]。內(nèi)皮損傷是導致糖尿病血管病變的重要因素。最近,有研究顯示HCY作用于培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞,通過活性氧(ROS)的大量釋放,刺激NF-κB的活化,從而使ICAM-1mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達上調(diào)及增強單核細胞的黏附和聚集[8]。適量的ROS是維持細胞正常生長和機體抗感染必需的,但過量的ROS可以對機體造成病理生理損害。另一項研究顯示,HCY可呈時間和劑量依賴性上調(diào)單核細胞對培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞的黏附,0.1mmol/L HCY可使單核細胞的黏附增加5倍,同時血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA的表達增加5倍[9]。為進一步探討高 HCY和高血糖兩種危險因子共存的致病危險性,本研究觀察高糖環(huán)境下HCY對血管內(nèi)皮細胞的影響與ICAM-1表達的關(guān)系,結(jié)果顯示HCY組血管內(nèi)皮細胞ICAM-1mRNA表達水平是增高的,而且HG+HCY組較HCY組和HG組增高的更明顯,提示ICAM-1可能參與HCY對糖尿病血管病變的加重作用,同時HCY處理培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞,血紅素加氧酶和谷胱甘肽過氧化酶的表達和活性均減弱,提示HCY可抑制細胞抗氧化能力[10]。HCY也可通過抑制細胞抗氧化酶的活性[11],減少活性氧的清除,導致活性氧在細胞內(nèi)和線粒體內(nèi)聚集[12]。活性氧又通過PKC及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化,啟動包括ICAM-1啟動子在內(nèi)的多種細胞因子及生長因子的轉(zhuǎn)錄,從而導致一系列靶基因的表達,最終導致細胞功能的改變,這些細胞因子組成了復雜的網(wǎng)絡(luò),作用于血管內(nèi)皮細胞,促進血管病變的發(fā)生和發(fā)展。近年來有學者提出蛋白質(zhì)同型半胱氨酸化(HcyT)在其致病中可能發(fā)揮重要作用[13],而大量研究HcyT可能使血管內(nèi)皮細胞呈劑量依賴性發(fā)生凋亡[14]。發(fā)現(xiàn)上述結(jié)論與本實驗研究結(jié)果一致,HG+HCY組刺激能使內(nèi)皮細胞發(fā)生氧化應激,使SOD下降,MDA升高,ICAM-1mRNA表達上調(diào),且HG+HCY組較HCY組和HG組改變的更顯著,并具有時間依賴性,提示HCY可能通過氧化應激機制上調(diào)ICAM-1的表達從而損傷血管內(nèi)皮細胞。

      黏附分子(adhesionmolecules)是由細胞產(chǎn)生、存在于細胞表面、介導細胞與細胞間或細胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子。黏附分子大多為糖蛋白,少數(shù)為糖脂,分布于細胞表面或細胞外基質(zhì)中,以配體一受體相對應的形式發(fā)揮作用,導致細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間或細胞-基質(zhì)-細胞之間的黏附,參與細胞的信號轉(zhuǎn)導與活化、細胞的伸展和移動、細胞的生長及分化、炎癥、血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程。ICAM-1是最重要的黏附分子之一,在體內(nèi)分布較廣泛,主要分布在白細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞等表面,但在血管內(nèi)皮細胞表達最強,在正常情況下僅有少量表達,但受缺氧、炎性細胞因子、內(nèi)毒素等刺激后,內(nèi)皮細胞ICAM-1表達增加,其增高是內(nèi)皮細胞和白細胞損害與激活的標志[15]。

      綜上所述,本實驗研究發(fā)現(xiàn)5mmol/L HCY刺激能使內(nèi)皮細胞發(fā)生氧化應激,SOD下降,MDA升高,同時氧化應激又能引起ICAM-1的表達上調(diào),產(chǎn)生大量的黏附分子,高表達的黏附分子通過增強血流細胞的黏附,造成相應微血管的阻塞和內(nèi)皮細胞損傷,從而引起糖尿病血管病變的發(fā)生,近來大量臨床試驗證明HCY在患者體內(nèi)的濃度高低可以反映其血管損傷的程度和心血管事件發(fā)生的概率高低[16],此外還有大量研究發(fā)現(xiàn)任何導致血中葉酸、維生素B12或維生素B6濃度降低的營養(yǎng)缺乏均會增加高HCY,而適當補充維生素B族或葉酸可降低血漿中HCY水平。因此早期干預高同型半胱氨酸血癥對糖尿病患者具有重要意義。

      [1]郭清華,陸菊明,秦海紅,等.2型糖尿病微血管病變患者血漿同型半胱氨酸的變化及其機制的探討[J].中國糖尿病雜志,2002,10:32-36.

      [2]You HZ,Gu Y.Effects of HELP therapy on acute ischemic stroke and vascular endothelial cell function [J].Therapeutic Apheresis& Dialysis,2007,11(3):171-176.

      [3]Matthew T,David Oxide AM,etal.Nitrous nesthesia on plasma homocysteine and endothelial function[J].Anesthesiology,2008,109(4):657-663.

      [4]Boaz D,Veronica MD.Elevated homocysteine is associated with reduced regional left ventricular function:The multi-ethnic study of atherosclerosis[J].Circulation,2007,115(2):180-187.

      [5]Hoogeveen EK,Kostense PJ,Jakobs C,etal.Hyperhomocysteinemia increase risk of death,especially in type 2diabetes:5year follow up of the Hoom Study[J].Circulation,2000,101:1506-1511.

      [6]Moriyama Y,Okamura T,Kajinami K,etal.Effects of serum B-vitamins on elevated plasma homocysteine levels associated with the muration of methylenetetrahydrofolate reductase gene in Japanese[J].Atherosclerosis,2002,164:321.

      [7]傅毅,陳生弟,陸國強.高同型半胱氨酸血癥與腦梗死及帕金森病關(guān)系的探討[J].中國微循環(huán),2003,7(4):211-213.

      [8]Postea O,Krotz F,Henger A,etal.Stereospecific and redox-sensitive increase in monocyte adhesion to endothelial cells by homocysteine[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(3):508-513.

      [9]Silver man MD,Tumuluri RJ,Davis M,etal.Homocysteine upregulates vascular cell adhesion molecule-1expression in cultured human aortic endothelial cells and enhances monocyte adhesion[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22:587-592.

      [10]Inoue I,Goto S,Matsunaga T,etal.The ligands/activators for peroxisome proliferators activated receptor alpha and PPARgamma increase Cu2+,Zn2+superoxide dismutase and decrease p22phox message expressions in essential endothelial cells[J].Metabolism,2001,50:3-11.

      [11]Weiss N,Heydrick SJ,Postea O,etal.Influence of hyperhomocysteinemia on the cellular redox state impact on homocysteine induced endothelial dysfunction[J].Clin Chem Lab Med,2003,41:1455-1461.

      [12]Heydrick SJ,Weiss N,Thomas SR,etal.L-Homocysteine and L-h(huán)omocystine stereospecifically induce endothelial nitric oxide synthase-dependent lipid peroxidation in endothelial cells[J].Free Radic Biol Med,2004,36:632-640.

      [13]Undas A,Perta J,Lacinski M,etal.Autoantibodies against nhomocysteinylated proteins in humans implications for atherosclerosis[J].Stroke,2004,35(6):1299-1304.

      [14]Weijun G,Juming L,Guoqing Y,etal.Effects of antioxidants on the reduction of homocysteine thiolactone-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells[J].J Geriat Cardiol,2006,3:107-111.

      [15]鄒效漫,郭清華,陸菊明,等.高同型半胱氨酸血癥對糖尿病腎病小鼠細胞間黏附分子-1表達的影響[J].中華糖尿病雜志,2004,12:293-296.

      [16]王芝蘭.同型半胱氨酸在心血管疾病中的檢測意義[J].醫(yī)學檢驗,2012,6(2):117-118.

      猜你喜歡
      活性氧半胱氨酸內(nèi)皮細胞
      淺議角膜內(nèi)皮細胞檢查
      雌激素治療保護去卵巢對血管內(nèi)皮細胞損傷的初步機制
      西安地區(qū)同型半胱氨酸參考區(qū)間的初步建立
      細胞微泡miRNA對內(nèi)皮細胞的調(diào)控
      TLR3活化對正常人表皮黑素細胞內(nèi)活性氧簇表達的影響
      同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關(guān)性分析
      痰瘀與血管內(nèi)皮細胞的關(guān)系研究
      86例同型半胱氨酸與腦梗死相關(guān)性分析
      硅酸鈉處理對杏果實活性氧和苯丙烷代謝的影響
      同型半胱氨酸、胱硫醚β合酶與腦卒中
      新宾| 木里| 门头沟区| 大姚县| 鹿泉市| 南和县| 桃江县| 黑水县| 方正县| 无为县| 年辖:市辖区| 余庆县| 新蔡县| 吉安市| 共和县| 沂水县| 阿图什市| 卓资县| 防城港市| 五大连池市| 平南县| 阿拉善右旗| 衡南县| 景宁| 富民县| 沙坪坝区| 安丘市| 综艺| 崇明县| 沭阳县| 丰台区| 马公市| 酒泉市| 汉川市| 罗江县| 龙胜| 南丹县| 南昌县| 宣恩县| 墨江| 翁源县|