全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO、TFPI及表達(dá)TF的影響1）

吳 萍，譚 茜，羅亞君，何義化，陳 博，殷紅艷，許光明

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞，能分泌作用不同的活性物質(zhì)，以維持血管收縮和舒張、抗凝與促凝平衡[1]。當(dāng)VEC功能受損時(shí)，其合成分泌功能失調(diào)，使血液呈高凝狀態(tài)。因此與心腦血管系統(tǒng)中的血栓事件發(fā)生具有密切關(guān)系[2]。近幾年國外研究表明，組織因子（tissue factor，TF）途徑是生理止血的凝血過程和病理血栓形成的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[3，4]，組織因子是外源性凝血酶途徑的啟動(dòng)因子，在正常生理活性凝血反應(yīng)及病理性血栓形成起重要作用[5]。內(nèi)皮細(xì)胞正常情況下并不表達(dá)TF，但在某些病理狀態(tài)及凝血酶作用下卻大量表達(dá)，這些成為目前國外研究的熱點(diǎn)，但在國內(nèi)研究較少。組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，具有抗凝、抗血栓等作用。NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的另一種生物活性物質(zhì)，具有抑制血小板黏附、聚集及拮抗內(nèi)皮素，調(diào)節(jié)TF表達(dá)，起抗血栓形成的作用。全蝎（Bathus martesckarsch）臨床多用于治療急性驚風(fēng)、中風(fēng)面癱、頭痛、破傷風(fēng)痙攣等癥，這類疾病常與體內(nèi)血小板活化、凝血酶形成等高凝狀態(tài)，乃至血栓形成有密切關(guān)系，抗凝、抗血小板成為治療這類疾病的重要手段[6]。因此抗血栓形成和消除高凝狀態(tài)，是治療此類疾病的重要手段之一。已有研究表明，全蝎具有抗凝和抗血栓形成及抑制血小板聚集的作用。為進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，本研究以凝血酶－血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)為對象，研究全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）抗凝功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由武漢大學(xué)典型物種保存中心提供。新生小牛血清（杭州四季青生物制品研究所產(chǎn)品）。RPMI－1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，磷酸緩沖鹽（PBS）干粉為武漢博士德公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱為美國謝爾登制造公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystens集團(tuán)產(chǎn)品。凝血酶為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所產(chǎn)品。TF、TFPI試劑盒購自美國Assaypro公司，NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。全蝎購自湖南省醫(yī)藥公司，經(jīng)水煮醇沉、凝膠過濾、離子交換層析等分離純化過程將其真空冷凍干燥成粉末，－20℃保存?zhèn)溆?，使用前用?0%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成所需濃度工作液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2 HUVEC培養(yǎng)與鑒定 將內(nèi)皮細(xì)胞加入RPMI－1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清、100kU／L鏈霉素、100kU／L青霉素）中，5%、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞呈多角形、鋪石樣鑲嵌排列，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，經(jīng)Ⅷ因子（FⅧ）免疫熒光鑒定并選擇生長良好的HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 選取生長良好的2代～3代細(xì)胞。將融合生長的HUVECs用0.25%胰蛋白酶消化吹打制成單細(xì)胞懸液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7.5×104個(gè)／mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞融合后，隨機(jī)分為空白對照組，凝血酶（10U／mL）刺激組，全蝎純化液高、中、低劑量組。全蝎純化液高、中、低劑量組加入10U／mL的凝血酶后分別加入24μg／mL、12 μg／mL、6μg／mL全蝎純化液?？瞻讓φ战M加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h進(jìn)行檢測。

1.4 檢測指標(biāo) 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液測定TFPI活性，細(xì)胞凍融液測TF活性，均采用發(fā)色底物法。NO含量測定采用硝酸還原酶法，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)TF和釋放TFPI的影響 全蝎純化液各劑量組能抑制基礎(chǔ)條件下HUVECs表達(dá)TF，凝血酶能明顯促進(jìn)HUVECs表達(dá)TF，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而全蝎純化液能顯著抑制其作用（P＜0.01）。HUVECs在基礎(chǔ)條件下能釋放一定量的活性物TFPI，凝血酶能明顯抑制HUVECs釋放TFPI，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而全蝎純化液能拮抗其作用（P＜0.05）。詳見表1。

表1 全蝎對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)TF和釋放TFPI、NO的影響（±s）

表1 全蝎對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)TF和釋放TFPI、NO的影響（±s）

組別 TF活性（%） TFPI活性（%） NO（μmol／L）空白對照組 6.12±1.95 2.05±0.81 7.00±1.32凝血酶組 13.98±1.122） 0.63±0.322） 10.76±1.961）全蝎高劑量組 4.89±0.984） 1.62±0.983） 27.32±3.124）全蝎中劑量組 5.22±0.864） 1.21±0.673） 20.48±2.444）全蝎小劑量組 6.43±1.014） 0.99±0.213） 17.44±2.204）與空白對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與凝血酶組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

2.2 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs釋放NO的影響HUVECs在基礎(chǔ)條件下能釋放定量的NO，凝血酶促進(jìn)HUVECs釋放NO，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；全蝎純化液能顯著地促進(jìn)HUVECs釋放NO，與對照組和凝血酶組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但凝血酶和全蝎純化液兩者之間無協(xié)同作用。詳見表1。

3 討 論

近年來的大量研究表明，與內(nèi)在凝血途徑相比，組織因子途徑（外源性途徑），在生理性止血過程和病理過程中的血栓形成具有更為重要的意義。TF是一種跨膜糖蛋白，在機(jī)體凝血過程中起至關(guān)重要的作用，是內(nèi)、外凝血系統(tǒng)的始動(dòng)因子，也是血栓形成的關(guān)鍵因素。VEC表達(dá)的TF是炎癥反應(yīng)和血栓形成的主要銜接物，研究抑制促VEC誘生性表達(dá)的TF物質(zhì)，已成為防治血栓性疾病的重要策略之一[7]?，F(xiàn)已證實(shí)，凝血酶能明顯增加HUVECs表達(dá)TF，已知TF增加又使凝血酶生成增加，二者具有互相加強(qiáng)效應(yīng)，這種正反饋?zhàn)饔脤?dǎo)致血液促凝活性增加，血小板易黏附、聚集，血栓形成。TF、凝血酶增多，有利于平滑肌細(xì)胞遷移、增生，加重內(nèi)皮細(xì)胞損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凝血酶能刺激HUVEC大量表達(dá)TF，而全蝎能明顯抑制凝血酶所誘導(dǎo)的TF表達(dá)，從而起保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和抗血栓形成的作用。

TFPI是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新型的抗凝物質(zhì)，是組織因子在體內(nèi)特異性的生理抑制劑，可以調(diào)節(jié)TF的活性[8]。它首先和FⅩa結(jié)合，然后在Ca2＋存在條件下，再與TF／FⅦa結(jié)合形成四聚體，從而抑制FⅩa和TF／FⅦa活性，起抗凝作用[9]。本研究表明，凝血酶能顯著增加HUVEC表達(dá)TF，而全蝎純化液能抑制這種作用。凝血酶能明顯抑制HUVEC的TFPI活性使TFPI活性降低。使血液呈高凝狀態(tài)，這與國外的研究報(bào)告相一致。結(jié)果顯示全蝎純化液可提高凝血酶誘導(dǎo)EVC培養(yǎng)液中的TFPI活性，表明其對凝血酶的抑制作用。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的另一種生物活性物質(zhì)，它可以使血管平滑肌舒張，血壓降低，抑制血小板黏附、聚集及平滑肌細(xì)胞增生、遷移，拮抗內(nèi)皮素、調(diào)節(jié)TF表達(dá)，起抗血栓形成和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，以外還可以清除氧自由基等。若內(nèi)皮受損，NO分泌減少，易導(dǎo)致血管痙攣，成為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全蝎純化液能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，這可能與它的凝血化瘀、抗凝、抗血栓形成機(jī)制和對心腦血管疾病具有治療作用有關(guān)。

以上研究結(jié)果顯示全蝎純化液可促進(jìn)HUVECs合成NO，可拮抗凝血酶抑制TFPI釋放，抑制凝血酶誘導(dǎo)的TF表達(dá)，可為臨床合理應(yīng)用全蝎提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]易小民，譚茜，彭延古，等.全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管性血友病因子和6－酮－前列腺素F1a的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2010，17（6）：334－336.

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