燕麥?zhǔn)人峋廾氐奶峒兗捌浠钚詸z測

伍甜 劉瑩 余超 邊強(qiáng) 田芳 黃瓊 陳華民 何晨陽

鞭毛素（flagellin）是細(xì)菌鞭毛的主要組分，不僅與鞭毛運(yùn)動(dòng)性有關(guān)，而且可以作為病原相關(guān)分子模式（PAMP）激發(fā)植物的免疫反應(yīng)（PTI）［1］。其N 端有一個(gè)由 22 個(gè)氨基酸組成的保守肽段 flg22，通過與植物受體FLS2 的識別及其信號傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)了擬南芥、番茄和煙草等植物的防衛(wèi)反應(yīng)［2-5］。同樣，通過flg22與水稻受體 OsFLS2 的識別作用，也可引起水稻的防衛(wèi)反應(yīng)，但這種反應(yīng)很微弱；而flg22或鞭毛素卻能激發(fā)過表達(dá)OsFLS2的水稻懸浮細(xì)胞強(qiáng)烈的防衛(wèi)反應(yīng)［6］。燕麥?zhǔn)人峋ˋcidovorax avenae sub.avenae，簡稱Aaa）不親和菌株N1141的鞭毛素能夠引起水稻過敏反應(yīng)，并伴隨著大量H2O2的產(chǎn)生［7，8］。表明細(xì)菌鞭毛素作為PAMP對單子葉植物水稻PTI 的誘導(dǎo)作用機(jī)理比較復(fù)雜，有必要進(jìn)行深入的探究。

本研究采用機(jī)械震蕩、丙酮沉淀以及離子交換層析進(jìn)行了蛋白提純，并對其誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生 H2O2的能力進(jìn)行測定，旨在探索一種能夠大量提純的可行方法，并且獲得提純、有活性的鞭毛素蛋白，用于后續(xù)的水稻 PTI 機(jī)理的解析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試菌株：Aaa菌株NB001由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院趙文軍研究員提供。水稻品種：日本晴（Oryza sativa ssp.japonica）由本實(shí)驗(yàn)室保存。Aaa 菌株NB001與水稻品種日本晴的存在不親和互作關(guān)系。

1.1.2 主要試劑 KB 培養(yǎng)基（20g蛋白胨、10mL甘油、1.5 g K2HPO4、1.5gMgSO4·7H2O、1000mL H2O）；2×SDS 電 泳上樣緩沖液（0.0615mmol/L Tris-HCl，pH6.8；1％ SDS，10％ 甘油，5％ β-巰基乙醇，0.002％溴酚藍(lán)）；染色液（0.125g考馬斯亮藍(lán)R250、30mL甲醇、10mL冰乙酸、加H2O定容至100mL）；脫色液（30mL甲醇、10mL冰乙酸，加H2O 定 容 至100mL）；PBS（0.27 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、NaCl 8g，KCl0.2 g、調(diào)節(jié)pH至7.4，加水定容至1L）；抗鞭毛素蛋白兔多克隆抗體（華大公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體（華大公司）；Super Ecl發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；DAB（AMRESCO公司）；蛋白Marker（預(yù)染蛋白質(zhì)Marker Ⅲ）（天根公司）。

1.1.3 儀器和設(shè)備 臺式恒溫振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；離心機(jī)（BECKMAN公司）；震蕩混勻器（VORTGX公司）；HPLC系統(tǒng)（GE公司）；陰離子交換柱（GE公司，5mL HiTrapTMSP HP）；陽離子交換柱（GE公司，5mL HiTrapTMQP HP）；垂直電泳槽（Junyi公司）；半干電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司）；化學(xué)發(fā)光采集系統(tǒng)（GE公司）；水浴鍋（PolyScience公司）；光學(xué)顯微鏡（OLYPUS 公司）。

1.2 方法

1.2.1 鞭毛素等電點(diǎn)和分子量預(yù)測 根據(jù)已測序的鞭毛素基因的編碼序列，通過Primer 5.0翻譯成為氨基酸序列，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站 ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）對 Aaa鞭毛素等電點(diǎn)（pI）、分子量進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2 菌體培養(yǎng)與蛋白粗提 接種細(xì)菌于4 L KB培養(yǎng)基中，在28℃下震蕩（200r/min）培養(yǎng)24h。離心（7000r/min×20min，28℃），收集菌體沉淀；加玻璃珠與30-40mL的ddH2O于離心管中，振蕩3min，收集上清為鞭毛素蛋白粗提液。

1.2.3 粗提液檢測及純化前處理 緩慢加入粗提液4倍體積的預(yù)冷丙酮，慢慢攪拌至析出大量蛋白，4℃放置過夜，沉淀蛋白。離心除去上清，收集蛋白后，靜置于通風(fēng)廚10min，待殘余丙酮揮發(fā)。加入50mL ddH2O 重懸蛋白，留取100μL粗提液重懸物，采用5％濃縮膠（上層），12％分離膠（下層）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測粗提物純度。其余粗提物用HCl調(diào)節(jié)至pH2.0，在常溫下攪拌30min，此時(shí)鞭毛素蛋白從鞭毛上解離出來，形成解離液。將解離液分成等體積2份，分別稀釋至300mL以降低鹽濃度，并分別調(diào)節(jié) pH至3.5和7.5，用濾膜（2.2μm）過濾，備用。

1.2.4 離子交換層析法純化 使用高效蛋白純化儀，分別通過陰、陽離子交換層析進(jìn)行蛋白純化。用濃度為15mmol/L的Tris-HCl，pH8.0的緩沖液作為A液（Start buffer），用1mol/L NaCl，通過加入HCl調(diào)節(jié)pH至7.0作為B液（elution buffer）。先用5倍柱體積的A液以5mL/min流速平衡層析柱，然后以3mL/min的流速，通過上樣泵上蛋白樣品（陽離子層析柱上pH為 3.5的粗提物樣品，陰離子層析柱上pH7.5的粗提物樣品）。然后用 2倍柱體積的A液，以5mL/min的流速?zèng)_洗層析柱。最后以線性方式洗脫蛋白（鹽梯度使用NaCl的濃度由0-1mol/L），洗脫10個(gè)柱體積，用UV 214nm 監(jiān)測洗脫峰，收集出峰的組份。

1.2.5 SDS-PAGE 檢測和 Western blot 驗(yàn)證 取出峰組份，吸取20μL與等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴中煮5min。處理好的樣品經(jīng)5％濃縮膠（上層），12％分離膠（下層）的SDS-PAGE凝膠電泳。一塊膠用考馬斯亮藍(lán)染色2h，脫色液脫色12h，檢測結(jié)果。另一塊膠用半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，在25 V恒壓下轉(zhuǎn)膜1h，所用的膜為PVDF膜；然后膜經(jīng)過5％的脫脂奶粉室溫封閉2h，PBS漂洗3次后，加入用PBS 1∶5000稀釋的鞭毛素蛋白多克隆抗體，孵育2h，用PBS漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，孵育2h，使用PBS漂洗4次，最后加入Super Ecl發(fā)光液，采集化學(xué)信號成像。

1.2.6 生物活性檢測 用DAB染色法進(jìn)行蛋白活性檢測。用浸潤法將純化蛋白（濃度0.3mg/mL）接種苗齡14d的水稻葉片，以15mmol/L的Tris-HCl（pH7.0）緩沖液作為對照。對接種部位葉組織取樣，浸入含0.01％ Triton-X-100和1mg/mL DAB的水溶液中，同時(shí)真空30min。葉片在室溫下過夜孵育，出現(xiàn)褐色-紅色沉淀物質(zhì)后，再將葉片浸入在95％乙醇∶乳酸∶苯酚（2∶1∶1）中，65℃孵育30min后，用50％乙醇沖洗，再用清水沖洗后，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鞭毛素等電點(diǎn)和分子量的預(yù)測

根據(jù)已經(jīng)測序的Aaa鞭毛素的基因序列，通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測該菌株的鞭毛素 pI 為 5.46，分子量為 49.37kD。

2.2 鞭毛素蛋白的提純

通過加入玻璃珠劇烈震蕩菌體的方法，使鞭毛與菌體分離。采用丙酮沉淀上清的方法，得到了大量的粗提物。SDS-PAGE電泳檢測（圖 1）發(fā)現(xiàn)，粗提物中鞭毛素蛋白含量較高，但是仍然含有較多的雜蛋白。

圖 1 燕麥?zhǔn)人峋廾卮痔嵛?SDS-PAGE 電泳分析

在pH3.5或 pH7.5的條件下，粗提物中大量蛋白均能夠結(jié)合到陽、陰離子層析柱上，洗脫峰較為單一（圖 2）。

2.3 鞭毛素蛋白的檢測

為了檢測蛋白的純化效果，對離子交換層析組份進(jìn)行驗(yàn)證。SDS-PAGE結(jié)果（圖 3）顯示，陰、陽離子交換層析純化后均能獲得一條明顯的蛋白條帶（45kD左右）；相比較而言，陽離子交換層析純化產(chǎn)物更純，未發(fā)現(xiàn)其它蛋白。Western blot分析表明，經(jīng)陰、陽離子交換層析純化的為鞭毛素蛋白。

圖 2 燕麥?zhǔn)人峋廾仉x子交換層析洗脫峰

圖 3 純化后燕麥?zhǔn)人峋廾氐臋z測

2.4 鞭毛素蛋白的活性檢測

通過 DAB 染色分析（圖4）顯示，純化后的鞭毛素蛋白能引起水稻葉片產(chǎn)生大量的 H2O2，而緩沖液處理則沒有 H2O2的產(chǎn)生，說明純化得到的鞭毛素蛋白具有生物學(xué)活性。

圖4 DAB 染色法檢測鞭毛素蛋白誘導(dǎo)水稻葉片 H2O2 產(chǎn)生

3 討論

由于細(xì)菌鞭毛素含量較低，在大規(guī)模提純等方面一直存在一些困難。目前大多數(shù)報(bào)道采用超高速離心提純法［9］，但由于受到儀器容量、離心條件的限制，提取量少，該法不適合大量提取。本研究對燕麥?zhǔn)人峋廾靥崛『图兓椒ㄟM(jìn)行了不同嘗試，采用機(jī)械震蕩、丙酮沉淀以及離子交換層析，成功地獲得了純化蛋白，為后續(xù)的大規(guī)模制備提供了技術(shù)支撐。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）通過玻璃珠機(jī)械震蕩，使鞭毛更易從菌體上脫落；（2）針對鞭毛素結(jié)構(gòu)較保守、耐受性較強(qiáng)的特點(diǎn)，通過加入丙酮破壞蛋白水化層，使粗提蛋白沉淀，從而有利于在酸性條件下蛋白解離；（3）鞭毛素（pI=5.46）無論帶負(fù)或正電荷，都可分別結(jié)合到陰、陽離子交換層析柱上。但陽離子交換層析的蛋白組份單一，而陰離子交換層析的有較多的雜帶。其可能的原因是，在pH=7.5條件下，粗提物中很多雜蛋白也帶負(fù)電荷，與鞭毛素一起結(jié)合到陰離子層析柱上，且結(jié)合力相仿，從而進(jìn)行線性洗脫時(shí)，兩者一同被洗脫下來；而在pH=3.5條件下，鞭毛素帶正電荷，能夠結(jié)合到陽離子層析柱上，并且能夠被洗脫下來；粗提物中雜蛋白在此pH條件，引發(fā)變性和空間構(gòu)象變化，不能結(jié)合到陽離子層析柱上，或結(jié)合力過大，導(dǎo)致無法洗脫。用1mol/L NaOH對層析柱重生過程中，發(fā)現(xiàn)大量雜蛋白被洗脫出來（實(shí)驗(yàn)室資料）。

此外，本研究純化的鞭毛素能引起水稻葉片產(chǎn)生H2O2，表明這種蛋白具有生物活性。鞭毛素是一種PAMP能夠引起水稻的PTI。因此，這種純化的、具有生物活性的鞭毛素蛋白可用于后續(xù)的水稻 PTI分子機(jī)理的解析。

4 結(jié)論

成功地組合利用機(jī)構(gòu)震蕩、丙酮沉淀和離子交換層析法，從Aaa中提純了具有生物活性的鞭毛素蛋白。

［1］ 武曉麗, 陳華民, 吳茂森, 等.細(xì)菌鞭毛素對植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)及其信號機(jī)制的激發(fā)［J］.植物保護(hù), 2011, 37（3）：12-16.

［2］ Felix G, Duran JD, Volko S, Boller T.Plantshave a sensitive perception system for themost conserved domain of bacterial flagellin［J］.The Plant Journal, 1999, 18（3）：265-276.

［3］ Robatzek S, Bittel P, Chinchilla D, et al.Molecular identification and characterization of the tomato flagellin receptor LeFLS2, an orthologue of Arabidopsis FLS2 exhibiting characteristically different perception specificities［J］.Plant Molecular Biology, 2007, 64（5）：539-547.

［4］ Meindl T, Boller T, Felix G.The bacterial elicitor flagellin activates its receptor in tomato cells according to the address-message concept［J］.The Plant Cell, 2000, 12（9）：1783-1794.

［5］ Hann DR, Rathjen JP.Early events in the pathogenicity of Pseudomonas syringae on Nicotiana benthamiana［J］.The Plant Journal,2007, 49（4）：607-618.

［6］ Takai R, Isogai A, Takayama S, et al.Analysis of flagellin perceptionmediated by flg22 receptor OsFLS2 in rice［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions, 2008, 21（12）：1635-1642.

［7］ Hirai H, Takai R, Iwano M, et al.Glycosylation regulates specific induction of rice immune responses by Acidovorax avenae flagellin［J］.Journal of Biological Chemistry, 2011, 286（29）：25519-25530.

［8］ Takakura Y, Che FS, Ishida Y, et al.Expression of a bacterial flagellin gene triggers plant immune responses and confers disease resistance in transgenic rice plants［J］.Molecular Plant Pathology,2008, 9（4）：525-529.

［9］ Kobayashi T, Rinker JN, Koffler H.Purification and chemical properties of flagellin［J］.Arch Biochem Biophys, 1959, 84：342-362.