氣滯血瘀證大鼠NO/NOS體系的變化

寧天一 王婷婷 姜 靜 程嘉藝

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)，110032)

氣滯血瘀證是指氣機(jī)阻滯而致血行瘀阻所表現(xiàn)的證候。常因情志不遂，閃挫外傷或寒邪內(nèi)阻等所引起。臨床表現(xiàn)胸脅脹滿或走竄疼痛，性情急躁，脅下痞塊，刺痛拒按，入夜更甚，或婦女痛經(jīng)，經(jīng)色紫暗，夾有瘀塊，舌紫暗或有瘀斑等。氣是人體內(nèi)至精至微的生命物質(zhì)，是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有推動(dòng)血液的生成、運(yùn)行，以及津液的生成、輸布和排泄等功能。中醫(yī)“氣”的概念較難把握，但“氣”畢竟是物質(zhì)的，有其物質(zhì)基礎(chǔ)才能完成其重要功能。為了初步探討 “氣”的本質(zhì)與氣體信號(hào)分子的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制氣滯血瘀病癥模型，觀察其模型體內(nèi)氣體信號(hào)分子NO的變化情況，研究是否與中醫(yī)理論中的“氣”存在相關(guān)性，為血瘀證及活血化瘀方藥的研究提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 NO試劑盒(20111123)、NOS試劑盒(20111123)(南京建成生物工程研究所)，Trizol(D9108A)、RT－PCR試劑盒(DRR019A)、瓊脂糖(D601)、Marker(D526A)引物(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康wistar大鼠，雌雄各半，體重180g～200g，隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、模型組、血府逐瘀湯低劑量組和高劑量組。

1.3 復(fù)制模型 采用多因素聯(lián)合刺激法造模［1］。刺激因素包括聲、光、電、冰水浴、束縛、夾尾，每天刺激2次，持續(xù)5周時(shí)間。

1.4 血漿NO含量測(cè)定 NO產(chǎn)生后在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化亞硝酸鹽(NO2－)和硝酸鹽(NO3－)，而 NO2－又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3－。利用硝酸還原酶特異性地將NO3－還原NO2－，通過(guò)顯色深淺測(cè)定 NO2－濃度高低［2］。

1.5 肝組織TNOS和iNOS活性測(cè)定 按NO和NOS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定NO合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)活性，結(jié)構(gòu)型NO合酶(cNOS)活性=TNOS活性－iNOS活性。

1.6 RT－PCR法測(cè)定肝組織eNOS基因表達(dá) 參照文獻(xiàn)［3－4］采用 Trizol試劑提取總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件eNOS、β－actin退火溫度65℃。采用凝膠成像分析儀掃描，測(cè)定目的基因和β－actin擴(kuò)增的A，計(jì)算其與β－actin的比值，見表1。

表1 eNOS和肌動(dòng)蛋白基因引物序列

1.7 頸總動(dòng)脈eNOS免疫組織化學(xué)分析 頸總動(dòng)脈石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15min，微波法抗原修復(fù)10min，滴加一抗，4℃過(guò)夜，次日順序加入二抗和三抗，分別 37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察eNOS在頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)情況［5］。用彩色病理分析系統(tǒng)測(cè)定eNOS陽(yáng)性細(xì)胞的著色灰階值?；译A值越小，說(shuō)明著色越深，反映eNOS表達(dá)量越多，以灰階值來(lái)進(jìn)行量化后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 血漿和肝組織NO含量及肝組織中酶活性檢測(cè)與對(duì)照組相比，模型組血漿和肝組織中NO含量明顯降低(P＜0.01)，低劑量組血漿及肝組織中NO含量明顯高于模型組(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，模型組TNOS、cNOS活性均明顯降低(P＜0.01)，低劑量組TNOS、cNOS活性明顯高于模型組(P＜0.05)，見表2。

2.2 肝組織eNOS基因表達(dá) 肝組織eNOS基因表達(dá)水平:與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織eNOS基因表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，低劑量組肝組織eNOS基因表達(dá)水平明顯高于模型組(P＜0.05)，見圖1。

表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8，s)

表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8，s)

注:與對(duì)照組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01，△△P ＜0.05。

分組 劑量(生藥量/kg)血中NO(μmol/L)肝組織NO(μmol/mg)TNOS酶活性(U/mg)cNOS酶活性(U/mg)2.77±1.73 5.87±1.72 0.31±0.04 0.19±0.04模型組 0.52±0.33＊＊ 0.52±0.24＊＊ 0.19±0.02＊＊ 0.04±0.01＊＊低濃度 15 2.37±0.53△△ 3.72±1.53△△ 0.24±0.02△△ 0.10±0.04△高濃度 15 1.88±1.04 2.26±1.28 0.22±0.02△△對(duì)照組0.04±0.05

圖1 大鼠肝組織中NOS基因表

2.3 頸總動(dòng)脈eNOS免疫觀察 與對(duì)照組比較模型組頸總動(dòng)脈eNOS灰階值明顯升高(P＜0.05)，與模型組比較低劑量組頸總動(dòng)脈eNOS灰階值明顯降低(P＜0.05，見表3、圖2。

圖2 大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS(×200)

表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(dá)(n=6，s)

表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(dá)(n=6，s)

注:與對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

0.18±0.01模型組 6 0.27±0.03＊＊低劑量組 6 15 0.21±0.07△高劑量組灰階值對(duì)照組組別 鼠數(shù)(只)劑量(mL/kg)6 15 0.22±0.05 6

3 討論

一氧化氮是一種化學(xué)性質(zhì)比較活潑的親脂性小分子化合物，在生物體內(nèi)由左旋精氨酸在NOS作用下最終生成，能夠持續(xù)產(chǎn)生并透過(guò)生物膜自由擴(kuò)散，具有舒張血管，降低血壓等生理功能，在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用［6］。臨床上應(yīng)用硝基類舒血管藥物已有一百多年，隨著研究的深入，人們了解其作用機(jī)制，實(shí)際上是作為NO供體。硝基類舒血管藥物引起的血管舒張作用直接取決于NO的生成量，并存在量效關(guān)系，對(duì)血瘀證有治療作用的硝基類舒血管藥物本質(zhì)是通過(guò)氣體信號(hào)分子發(fā)揮作用［7］。氣滯血瘀證的形成是一個(gè)比較漫長(zhǎng)的過(guò)程，與情緒、飲食、年齡、環(huán)境、疾病等諸多因素有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為精神情志活動(dòng)是以臟腑所化生和貯藏的精氣血為物質(zhì)基礎(chǔ)，而肝主疏泄在志為怒，怒以肝藏血為物質(zhì)基礎(chǔ)，肝貯藏血液、調(diào)節(jié)血流量及防止出血有賴于肝疏泄氣機(jī)得以實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)中大鼠經(jīng)多因素聯(lián)合刺激致使情志發(fā)生改變，長(zhǎng)期處于暴怒狀態(tài)，從而建立了氣滯血瘀模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氣滯血瘀證NO含量和NOS表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，給予行氣活血藥后NO含量和NOS表達(dá)水平顯著性增加(P＜0.01)，二者變化趨勢(shì)一致，這也驗(yàn)證了NO舒張血管功能，研究揭示行氣活血藥可以上調(diào)NO/NOS體系。有研究表明［8］機(jī)體組織缺血再灌注后內(nèi)皮功能受損，組織細(xì)胞會(huì)形成不可逆性損傷，組織缺血后eNOS活性、eNOS基因表達(dá)水平和NO含量均明顯降低，缺血組織恢復(fù)灌注后，eNOS活性、eNOS基因表達(dá)水平和NO含量低于基礎(chǔ)值，恢復(fù)灌注2 h，上述指標(biāo)接近基礎(chǔ)值，這是機(jī)體自我保護(hù)的一個(gè)過(guò)程。中醫(yī)理論中“氣”是存在于人體內(nèi)的至精至微的生命物，是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有很強(qiáng)的活力，能夠推動(dòng)血液的生成、運(yùn)行，以及津液的生成、輸布和排泄等作用，存在生命物質(zhì)和生理功能雙重屬性。中醫(yī)關(guān)于“氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣滯則血瘀”的論述，反映了氣血在生理病理方面的相互作用和相互致病的密切關(guān)系。進(jìn)一步深入探討氣的本質(zhì)和氣血關(guān)系，可以為治療血瘀證提供新的途徑，將對(duì)中西醫(yī)結(jié)合血瘀證的研究具有重要的意義。

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