六神丸對H22肝癌腹水移植瘤PDGF與VEGF表達的影響及相關機制探討

齊元富 李慧杰 李 靜

(1山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南，250011;2山東中醫(yī)藥大學，濟南，250355)

Folkman早在1971年就提出了腫瘤發(fā)生發(fā)展具有血管依賴性的觀點，研究腫瘤血管生長調節(jié)機制一度成為關注的焦點，而以抑制腫瘤血管生成為靶點阻斷腫瘤生長及轉移成為腫瘤防治的重要途徑［1］。傳統(tǒng)中成藥六神丸作為中醫(yī)學“攻毒治法”的代表方劑，其抗腫瘤的作用日益受到重視。本研究意在探討六神丸對H22肝癌腹水移植瘤PDGF與VEGF表達的影響及其可能機制，以期為中醫(yī)藥抗腫瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 H22肝癌荷瘤小鼠(腹水型)，昆明小鼠，購自山東省醫(yī)學科學院。

1.2 主要藥品及試劑 六神丸(蘇州雷允上制藥生產，批號 HA1001)，順鉑(齊魯制藥生產，批號04090291)。兔抗鼠VEGF多克隆抗體試劑盒(編號SA2252)，兔抗鼠PDGF單克隆抗體(編號BA1498)，SABC免疫組化試劑盒(兔IgG 1/2KIT，編號SA1065)，二氧基聯苯胺濃縮顯色液(編號AR1065)，均為博士德公司產品。

1.3 主要儀器 高清晰度HP2AS－1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

1.4 H22肝癌腹水移植瘤模型的建立 脫頸椎處死接種傳代7d的H22肝癌荷瘤小鼠，無菌條件下取腹水于容器冰塊保存。并留取部分腹水觀察細胞形態(tài)及細胞計數，滴腹水于玻片涂片，瑞氏染色，鏡下細胞分類計數，其中瘤細胞數應≥95%，并取0.9mL加0.1mL臺盼藍染色，細胞計數瘤細胞總數及死細胞數，活細胞記數＞95%。將肝素管內細胞調整細胞濃度為1×107/mL備用，取昆明小鼠每只于右腋窩皮下接種0.2mL備用細胞液建立移植瘤模型。

1.5 實驗分組 將40只成功接種24 h后的移植瘤模型小鼠隨機分為4組，每組10只，開始給藥。1)對照組:灌服生理鹽水，0.4mL/只，1次/d;2)六神丸組:灌服濃度為7.5mg/mL的六神丸溶液，0.4mL/只，1次/d;3)順鉑組:腹腔注射濃度為0.1mg/mL的順鉑，0.2mL/只，1次/2日，共2次;4)聯合組(六神丸 +順鉑):2)+3)。用藥10天，末次給藥后1h處死小鼠，剝取瘤體組織。

1.6 實驗方法 瘤體組織經10%中性福爾馬林固定48h，常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋，每一組織塊連續(xù)4μm切片4張。免疫組化方法采用SABC法染色，脫蠟至水化的切片經微波熱抗原修復，血清封閉，按組別加兔抗鼠VEGF多克隆抗體或兔抗鼠PDGF單克隆抗體，并設立陰性對照(以PBS緩沖液替代一抗)，DAB染色，具體按試劑盒說明逐步操作。顯微鏡下觀察PDGF與VEGF表達情況，高清晰度HP2AS－1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行光密度和強度測定，經分析軟件掃描統(tǒng)計其平均灰度值和平均面密度陽性率，平均面密度陽性率=陽性目標面密度/(陽性+陰性目標面密度)×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 所獲數據在統(tǒng)計軟件SPSS17.0上運行處理，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 腫瘤組織血小板源生長因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)表達情況 細胞漿或細胞核著棕黃色代表PDGF陽性染色。鏡下觀察:對照組中可見腫瘤組織及其間質中有大量呈片狀或團塊狀分布的棕黃色顆粒，陽性染色以對照組最明顯，而各藥組陽性表達相對較少。統(tǒng)計結果顯示:對照組移植瘤組織中PDGF表達平均灰度值較高，六神丸組、順鉑組及聯合組平均灰度值均顯著低于對照組(P＜0.01)，其中，聯合組灰度值最低，抑制作用最明顯;而與順鉑組比，聯合組亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);對照組移植瘤組織中PDGF平均面密度陽性率最高，六神丸組、順鉑組及聯合組均顯著低于對照組(P＜0.01)，以聯合組最低;而與順鉑組比，聯合組亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);說明六神丸與順鉑聯用，抑制PDGF表達作用更加顯著，見表1。

表1 H22肝癌腹水移植瘤組織PDGF表達情況

2.2 腫瘤組織血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)表達情況 腫瘤細胞及其附近的血管內皮細胞漿或胞膜出現棕黃色顆粒代表VEGF染色為陽性表達。鏡下可見，對照組腫瘤組織及其間質中有大量呈片狀或團塊狀分布的棕黃色顆粒，陽性染色以對照組最明顯，而各藥組陽性表達相對較少。統(tǒng)計結果顯示:對照組移植瘤組織中VEGF表達平均灰度最高，六神丸組、順鉑組及聯合組平均灰度值均顯著低于對照組(P＜0.01)，以聯合組抑制作用最明顯;而與順鉑組比，聯合組亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);移植瘤及其間質中VEGF表達對照組平均面密度陽性率最高，六神丸組、順鉑組及聯合組均顯著低于對照組(P＜0.01)，且以聯合組最明顯;而與順鉑組比，聯合組亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);說明六神丸與順鉑聯用，抑制VEGF表達作用更加顯著，見表2。

表2 H22肝癌腹水移植瘤組織VEGF表達情況

3 討論

惡性腫瘤是當今全球突出的公共衛(wèi)生問題，目前已成為威脅人類健康的最嚴重疾病之一，近10年來，其總體發(fā)病情況在世界各國呈上升趨勢，防治形勢十分嚴峻［2］?；谘苌煽纱龠M腫瘤生長、浸潤和轉移，以抗腫瘤血管生成達到抑制腫瘤生長和轉移為目的成為治療腫瘤的有效策略，而血管生成抑制物多通過直接作用于血管內皮細胞、阻斷血管生成因子，抑制基質反應或降解等幾個環(huán)節(jié)達到抑制作用［3］。在眾多與血管有關的因子中，VEGF是迄今鑒定出來的最重要的血管生成因子，其可刺激血管內皮細胞的有絲分裂、誘導血管新生，在病理生理性血管生長過程中起關鍵作用，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關［4］。PDGF是重要的血管生長因子及強有力的促細胞分裂原，研究發(fā)現其參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。腫瘤細胞釋放PDGF不僅可誘導細胞遷移及刺激細胞增殖，對腫瘤血管發(fā)生起著直接的作用，還可通過上調VEGF表達水平間接誘導血管生成，即腫瘤中PDGF可通過自分泌和旁分泌信號途徑加速腫瘤細胞生長、浸潤及刺激血管再生［6］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤防治中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現一些中藥的有效成分及復方有明顯的抗新生血管作用，在抑制腫瘤血管生成中具有良好的應用前景。而六神丸是攻毒治法的代表方劑，其抗腫瘤作用一方面可直接殺傷腫瘤細胞，另一方面可通過提高機體免疫力、利用自身防御機能間接殺傷腫瘤細胞［7］。

前期工作中初步研究表明六神丸對腫瘤血管形成有明顯抑制作用［8］，為進一步探討其機制，本研究采用體內動物實驗方法，在建立H22肝癌腹水移植瘤模型的基礎上分組給藥干預，運用免疫組織化學法測定PDGF與VEGF的表達情況。結果顯示:移植瘤中六神丸組、順鉑組及聯合組的PDGF及VEGF表達平均灰度值及面密度陽性率均顯著低于對照組，經統(tǒng)計有顯著性意義，且聯合組灰度值最低、優(yōu)于六神丸及順鉑單用，抑制作用最明顯，提示六神丸與順鉑聯合應用產生協同作用。進一步證實，六神丸抗腫瘤血管生成的機理與其抑制PDGF與VEGF表達密切相關，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

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