復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒的初步實(shí)驗(yàn)研究

譚本仁 徐曉梅 羅 君 郭基燕 許衛(wèi)關(guān)

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東韶關(guān) 512026；2.廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東韶關(guān) 512028

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染會(huì)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生，是引起肝硬化、肝細(xì)胞癌的重要因素之一，每年約有50 萬(wàn)人死于由HBV 感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病[1-2]，目前臨床尚無(wú)治療乙肝的特效藥物。復(fù)方葉下珠滴丸是由葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草、茵陳、丹參、柴胡等十六味草藥經(jīng)科學(xué)提取工藝精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益氣健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能等功效，能防治急慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）技術(shù)和熒光定量（PCR）方法，分析復(fù)方葉下珠滴丸對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)液及HBsAg 陽(yáng)性人血清培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 含量的影響， 觀察復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒的作用。

1 儀器與材料

1.1 試藥與試劑

試藥：采用復(fù)方葉下珠滴丸處方中十六味草藥以水提醇沉法（加水十倍，煎煮1 h，醇沉濃度為60%）制成的流浸膏（每1 mL 含原生藥材1 g）為試藥。

試劑：HBsAg、HBeAg 診斷試劑盒 （新波生物技術(shù)公司）， 靶細(xì)胞選擇HepG2.2.15 細(xì)胞 （HBV 全基因傳染的HepG2 細(xì)胞），HBV DNA 熒光定量PCR 試劑盒（上海復(fù)興生物技術(shù)公司）。

1.2 儀器

EFFICUTA2710 免疫分析儀和全自動(dòng)樣本前處理系統(tǒng)，Roche Light Cycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)，37℃5%CO2培養(yǎng)箱（Phermo）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS v19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2.2.15 細(xì)胞按1 ×105/mL 濃度加入2個(gè)24 孔培養(yǎng)板中，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d 后換液，將試藥稀釋，分八組不同濃度藥液各滴入4個(gè)孔，空白對(duì)照組以生理鹽水滴入，亦4個(gè)孔，加藥培養(yǎng)于72 h 后各收取1孔細(xì)胞上清液，用 ELISA 測(cè)定 HBsAg、HBeAg 和PCR 檢測(cè)其HBV DNA 含量，并將每組數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)T 檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)方葉下珠滴丸試藥最佳抑制效果濃度為120mg/mL。為考察其最佳抑制時(shí)間，再以120mg/mL濃度的復(fù)方葉下珠滴丸試藥，按以上方法培養(yǎng)，加藥培養(yǎng)后于 24、48、72、96 h 后收取 1 孔細(xì)胞上清液再檢測(cè)其HBsAg、HBeAg 和 HBV-DNA，48、72、96 h 組間數(shù)據(jù)分別與24 h 組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同濃度的復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結(jié)果比較（±s）

表1 不同濃度的復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結(jié)果比較（±s）

注：與空白對(duì)照比較，*P<0.01

復(fù)方葉下珠滴丸濃度（mg/mL）HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）20 40 60 80 100 120 140 160空白對(duì)照1.851±0.047*1.740±0.110*0.956±0.017*0.742±0.014*0.562±0.012*0.543±0.005*0.521±0.015*0.552±0.014*2.657±0.257 5.245±0.155*5.234±0.139*5.190±0.138*5.123±0.129*5.101±0.135*4.722±0.144*4.025±0.167*5.081±0.138*6.359±0.106 549 500±17 517 502 300±17 658*464 500±15525*412 700±15697*293 200±21 740*98 700±2 804*121 000±12 152*109 000±13 321*554 300±19 794

表2 不同時(shí)間的復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結(jié)果比較（±s）

表2 不同時(shí)間的復(fù)方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結(jié)果比較（±s）

注：與24 h 組比較，*P<0.01

項(xiàng)目 24 h 48 h 72 h 96 h HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）1.812±0.0800.641±0.012*0.533±0.022*0.535±0.024*5.321±0.2185.065±0.1444.101±0.135*4.067±0.140*546300±18621312 500±16 800*75700±987*43 500±1 848*

2.2 血清培養(yǎng)

將復(fù)方葉下珠滴丸試藥稀釋為120 mg/mL 溶液分5 組加入HBsAg 陽(yáng)性人血清（HBsAg 為2.634 ng/mL，HBeAg 為4.799 PEIU/mL，HBV-DNA 為 650 300 IU/mL）， 對(duì)照組則加入生理鹽水，于37℃孵育72 h，取上清液分別用ELISA測(cè)定各組HBsAg、HBeAg 和 PCR 測(cè)定各組HBV-DNA，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方葉下珠滴丸對(duì)抗人體血清結(jié)果比較（±s）

表3 復(fù)方葉下珠滴丸對(duì)抗人體血清結(jié)果比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

組別 HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）試藥組（120 mg/mL，n=5）對(duì)照組（n=5）0.992±0.066*2.253±0.151 3.561±0.163*4.885±0.106 102 500±7 069*651 200±21 998

3 討論

復(fù)方葉下珠滴丸是以葉下珠為主藥經(jīng)科學(xué)提取工藝精制而成的滴丸，葉下珠為大戟科植物，有清熱利尿、平肝明目、消積解毒、止瀉之功效，含鞣質(zhì)類、黃酮類、香豆素類等多種活性成分[3]，對(duì)肝損害具有保護(hù)作用，能預(yù)防原發(fā)性肝癌發(fā)生[4]，具有抗肝纖維化、抗乙型肝炎病毒的作用[5]，并對(duì)肝癌、胃癌多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[6-7]。輔藥中半邊蓮對(duì)肝癌也有明顯的抑制作用[8]，半枝蓮則可提高機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)肝損傷有保護(hù)作用[9]，雞骨草也有顯著的抗乙肝病毒作用[10]。

在HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，隨著復(fù)方葉下珠滴丸試藥濃度的增加，對(duì)乙肝病毒的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，但其試液濃度為140 mg/mL 時(shí)對(duì)HB-sAg、HBeAg 抑制作用最強(qiáng)，而其對(duì)HBV DNA的抑制作用最強(qiáng)濃度則為120 mg/mL；而其最佳抑制時(shí)間的培養(yǎng)試驗(yàn)中，72 h 組與96 h 組中的HBsAg、HBeAg 濃度降低并無(wú)差異，HBV DNA 抑制作用卻與時(shí)間呈一定的依賴性；在血清學(xué)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方葉下珠滴丸能顯著降低HBsAg濃度，具有明顯抗HBV的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方葉下珠滴丸具有明顯的抗乙肝病毒作用，今后筆者將做進(jìn)一步的藥效學(xué)研究，為臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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