蛇床子素對膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)效應(yīng)

趙京禹 費(fèi) 翔 岳 琦 郭 徽 鄧城旗 郝建華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，北京 100037

膿毒癥一般是由于重大外科手術(shù)或嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷和缺血再灌注損傷引起的并發(fā)癥，具有極高的發(fā)病率和病死率，是重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）患者死亡的首要因素[1-2]。嚴(yán)重的膿毒癥可以導(dǎo)致多個器官的功能損傷，臨床表明肺一般最先受到影響導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[3-4]。 據(jù)臨床調(diào)查統(tǒng)計，ICU膿毒癥患者一般有大于50%的可能發(fā)生急性肺損傷，其極高的發(fā)病率和病死率是ICU面臨的一個重大難點(diǎn)[5-6]。膿毒癥是由于感染引起的全身炎性反應(yīng)[7]，雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)急速發(fā)展和新型抗生素的不斷運(yùn)用，但是膿毒癥和其并發(fā)癥并沒有受到有效的遏制[8]，其發(fā)病率高居不下[9]。急性肺損傷是由于肺部不受控制的炎性反應(yīng)導(dǎo)致急性發(fā)生的進(jìn)行性呼吸衰竭，目前并沒有有效的治療方法和途徑。因此，探討膿毒癥急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制和追尋有效的治療藥物和手段是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要的任務(wù)。

蛇床子素（Osthole）是從蛇床子中提取的，具有多種藥理活性，研究表明其對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)疾病都具有顯著的療效，同時還具有抑癌的功能[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Osthole還具有抑菌消炎的作用，對金黃色葡萄桿菌和綠膿桿菌等有顯著的抑制作用并且能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[11-12]。因此，本研究以膿毒癥急性肺損傷大鼠為模型來研究探討Osthole對急性肺損傷的作用效果，旨在為該病的預(yù)防和臨床治療提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡雄性SD大鼠（SPF級）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體重170～230 g，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 主要試劑 蛇床子素（成都曼思特生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；戊巴比妥鈉（上?；瘜W(xué)試劑公司）；二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海生工）；IL-6和TNF-α檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；HRP-IgG （Sigma，USA）；活性caspase-3 抗體和 β-actin 抗體（Santa Cluz，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建及分組 動物模型的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報道過的盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)[13]。SD大鼠實(shí)驗(yàn)術(shù)前適應(yīng)生存環(huán)境3 d，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。皮膚消毒后，在前腹正中線處切口，辨認(rèn)并小心取出盲腸，在距離盲端1.5 cm處用絲線結(jié)扎，然后用18號針頭在盲腸結(jié)扎處遠(yuǎn)端穿扎兩次，擠出腸內(nèi)少許糞便，然后歸位和關(guān)腹。術(shù)后采用腹腔注射生理鹽水（24 mg/kg）補(bǔ)充體液流失。實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組（Sham）進(jìn)行手術(shù)但不結(jié)扎；急性肺損傷模型組（ALI）盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)處理；低劑量組（ALI+Osthole，100mg/kg）；高劑量組（ALI+Osthole，200 mg/kg）， 術(shù)后 2 h腹腔注射，12 h后注射第2次。第2次注射24 h后，麻醉處死大鼠，取材分析。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液的收集 大鼠麻醉處死，開腹取左肺葉采用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗5次（0.5 mL/次），收集灌洗液，12 000 r/min 低溫 4℃離心15 min，小心吸取上清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量 蛋白含量的測定按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作。在565 nm波長處測定，結(jié)果用g/L表示。

1.2.4 肺組織MPO、MDA和SOD的測定 取大鼠肺組織稱重0.1 g左右，漂洗干凈，洗去血液，濾紙擦干，加入勻漿介質(zhì)進(jìn)行勻漿。勻漿液10000r/min，離心10min，取上清備用檢測。MPO測定按MPO測定試劑盒說明，樣品孔中加入0.1 mL樣品稀釋液，后加入肺組織勻漿上清液0.02 mL，同時做好空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔；封住板孔，37°C放置30 min；反復(fù)洗滌板條5次。每個孔中各加入50 μL的酶聯(lián)物，封住板孔，37°C放置30 min；反復(fù)洗滌板條5次。每個孔內(nèi)各加入50 μL底物 A、B，封住板孔，37°C 放置 10 min，每個孔內(nèi)加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。立即取出用分光光度計測定460 nm處OD值。MDA測定：將工作液、緩沖液、沉淀液和40 μL稀釋好的肺勻漿液按順序加進(jìn)測試管內(nèi)；對照管中除不加肺勻漿液，余步驟相同；輕輕混勻，分別將試管口用保鮮膜扎緊，用針頭在保鮮膜上扎一個小孔，95℃水浴50 min；流水下冷卻至室溫，加1 mL蒸餾水和5 mL正丁醇吡啶抽提液，漩渦震蕩1 min，532 nm波長處測定OD值。SOD測定：樣品孔中加入0.1 mL樣品稀釋液，加入肺組織勻漿上清液0.02 mL，同時做好空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔；封住板孔，37°C放置30 min，洗滌板條5次。每個孔中各加入50 μL的酶聯(lián)物，封住板孔，37℃放置30 min；洗滌板條，每個孔內(nèi)各加入50 μL底物A、B，封住板孔，37℃放置 10 min，加入終止液 50 μL，終止反應(yīng)，500 nm波長處測定OD值。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞因子水平測定 提前30 min從取出冰箱中試劑盒，溫度下降到室溫；濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（0.05%）；凍干標(biāo)準(zhǔn)品用其稀釋液1 mL徹底溶解混勻，放置15 min。制備梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：從冰箱中取支氣管肺泡灌洗液（BAL）上清，自然升溫至室溫。根據(jù)先前預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況稀釋成合適的濃度；濃縮的生物素抗體以及酶結(jié)合物均用其相應(yīng)的稀釋液進(jìn)行稀釋，分別在臨用前15 min配好。將準(zhǔn)備好的待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品分別加入各反應(yīng)孔中（0.1 mL/孔）。37℃孵育 90 min，洗滌 5 次。加入生物素化抗體（0.1 mL/孔），暗處 37℃孵育 30 min，洗滌5次。每孔加顯色劑 0.1 mL，37℃，15 min，避光顯色。加入100 μL終止液，終止顯色，450 nm測量OD值。

1.2.6 Western blot方法 提取肺組織蛋白，BCA法測蛋白的濃度。取蛋白樣品30 μg，進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白通過點(diǎn)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用1%麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)移效果。而后，將膜放在10 mL封閉液中（2%脫脂奶粉，TBS （Tris-buffered saline，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5 配制）1 h； 加入一抗 （1∶1000），4℃過夜孵育；TBST（TBS 含 0.02%Tween）洗 3次，加入二抗 HRP-IgG（1∶10000）室溫孵育 2 h；TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，暗處發(fā)色。發(fā)色液現(xiàn)用現(xiàn)配（1 mL 4-氯-1-萘酚（6 mg/mL 甲醇配制），9 mL TBS，6 μL H2O2）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對BAL蛋白總量的影響

結(jié)果顯示，ALI 組蛋白總量 [（0.48±0.04）g/L]與Sham組相比急劇增加（P＜0.01），當(dāng)用蛇床子素處理后，BAL蛋白含量顯著降低（P＜0.05），而高劑量的蛇床子素（200 mg/kg）[（0.26±0.02）g/L]比低劑量的蛇床子素 （100 mg/kg）[（0.33±0.03）g/L]效果更加明顯（P ＜ 0.05）。 見圖 1。

圖1 蛇床子素對BAL蛋白總量的影響

2.2 蛇床子素對MPO、SOD和MDA水平的影響

結(jié)果顯示，ALI組中SOD的水平顯著下降，而MDA和MPO的水平則顯著升高（P＜0.05），說明氧化應(yīng)激反應(yīng)在ALI中顯著增加，當(dāng)用蛇床子素處理后，這些異常變化則被顯著抑制。見表1。

表1 蛇床子素對氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響（±s）

表1 蛇床子素對氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響（±s）

注：與 Sham 組比較，*P＜0.05；與 ALI組比較，#P＜0.05；Sham 組：假手術(shù)組；ALI：急性肺損傷模型組；ALI+Osthole：蛇床子素處理的急性肺損傷模型組；MPO：髓過氧化物酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

Sham組ALI組ALI+Osthole組（200mg/kg）ALI+Osthole組（100mg/kg）22.934±3.257 9.657±1.237*14.679±1.035#17.639±1.893#5.634±0.860 15.568±2.987*9.345±1.979#11.336±1.236#7.534±1.812 15.651±1.137*10.884±1.811#9.012±0.896#組別 SOD（U/mg protein）MDA（nmol/mg protein）MPO（U/g wet tissues）

2.3 蛇床子素對細(xì)胞因子水平的影響

結(jié)果顯示，與Sham組相比ALI組中IL-6水平明顯升高（P＜0.05），當(dāng)用蛇床子素處理時，IL-6水平明顯降低（P＜0.05），而TNF-α的水平變化也是相同的趨勢（P＜0.05），表明蛇床子素可以通過調(diào)控促炎因子的水平來抑制炎性反應(yīng)。見圖2。

圖2 蛇床子素對IL-6和TNF-α水平的影響

2.4 蛇床子素對細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，急性肺損傷導(dǎo)致活性caspase-3的水平急劇增加，而當(dāng)蛇床子素處理后，活性caspase-3的水平顯著下降，表明蛇床子素對肺組織細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用。見圖3。

圖3 蛇床子素對活性caspase-3水平的影響

3 討論

膿毒癥是重ICU患者死亡的最首要的原因，常常導(dǎo)致各器官的損傷，特別是肺最先受到損傷，膿毒癥相關(guān)的急性肺損傷也是ICU發(fā)病率和致死率最高的一種臨床疾病[14-16]。急性肺損傷通常由于全身炎性反應(yīng)失控，導(dǎo)致劇烈的炎性反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子和介質(zhì)作用損傷肺泡上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管內(nèi)蛋白質(zhì)大量滲出，產(chǎn)生肺泡性水腫和間質(zhì)性肺水腫，最終引起急性呼吸衰竭[17-18]。如何防治和治療膿毒癥相關(guān)的急性肺損傷，降低其發(fā)病率和病死率，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的所面臨的難點(diǎn)。中藥具有毒性低、安全高、藥源充足等特點(diǎn)，因此在治療膿毒癥相關(guān)的急性肺損傷中具有潛在的前景。Osthole是從中草藥蛇床子中提取的一種成分，其全名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素。近年來國內(nèi)外研究學(xué)者都對Osthole的藥理活性做了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗癌、抗毒、抗菌和抗炎等多種藥效功能。本研究以大鼠為模型，主要探討了Osthole對急性肺損傷的保護(hù)相應(yīng)及其作用的初步機(jī)制。

急性肺損傷主要病理變化是肺泡上皮細(xì)胞和肺泡微血管通透性顯著增高，肺的炎癥損傷通常會導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞功能受損，肺泡內(nèi)的蛋白質(zhì)滲出，對呼吸功能造成嚴(yán)重的障礙，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的大量外滲。針對肺泡上皮細(xì)胞通透性的研究也是當(dāng)前的熱點(diǎn)。有報道稱阻斷熱休克蛋白HSP90的表達(dá)，可以顯著降低肺泡上皮細(xì)胞和微細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的通透性提高膿毒癥大鼠模型的生存率[19-20]。Rac-1的活化可以穩(wěn)定血管的內(nèi)皮細(xì)胞，降低血管的通透性，對膿毒癥大鼠具有顯著的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)也表明蛇床子素可以降低急性肺損傷引起的BAL蛋白含量升高的異常變化，對細(xì)胞通透性的改善具有顯著的效果。為了探究蛇床子素是否對肺泡蛋白質(zhì)滲出的作用，本研究檢測了各實(shí)驗(yàn)組BAL蛋白含量的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷組蛋白總量與對照組相比急劇增加 （P＜0.01），當(dāng)用蛇床子素處理后，BAL蛋白含量顯著降低 （P＜0.05），而高劑量的蛇床子素（200 mg/kg）比低劑量的蛇床子素（100 mg/kg）效果更加明顯（P ＜ 0.05）。

細(xì)菌感染通常會引起中性粒細(xì)胞的浸潤和活化，釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)?；钚匝醯倪^量積累導(dǎo)致基因突變和蛋白生活，對細(xì)胞功能和機(jī)體都造成極大的損害，造成嚴(yán)重的病理結(jié)果[21]。急性肺損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)已有大量報道，活性氧的過量積累也是造成肺細(xì)胞通透性改變的主要原因[22]。MPO是中性粒細(xì)胞的重要標(biāo)志物，也是重要的過氧化物酶類，其水平與中性粒細(xì)胞的活化強(qiáng)度密切相關(guān)。因此，通過測定MPO的水平可以反映中性粒細(xì)胞的活化和浸潤程度。中性粒細(xì)胞和相關(guān)炎癥細(xì)胞的活化和浸潤，釋放大量的促炎癥因子例如IL-6和TNF-α，促炎因子通常經(jīng)過信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)使炎性反應(yīng)級聯(lián)放大，不但加重肺損傷，而且損傷免疫系統(tǒng)[23]。IL-6和TNF-α是許多炎性反應(yīng)中重要的兩種促炎癥細(xì)胞因子，為了探討Osthole對促炎因子的影響，本研究檢測了BAL中這兩種細(xì)胞因子水平的變化。氧化應(yīng)激反應(yīng)是ALI的重要病理變化，過量的活性氧（ROS）通常會導(dǎo)致基因突變和蛋白。大量中性粒細(xì)胞的浸潤引起呼吸爆炸，會產(chǎn)生過多的過氧化物。為了探討Osthole對ALI中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，本研究檢測了大鼠肺組織中SOD，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA以及中性粒細(xì)胞分泌的標(biāo)志物MPO。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Osthole可以顯著抑制急性肺損傷引起MPO水平升高，即可以抑制中性粒細(xì)胞的活化和浸潤，從而可以緩解炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。抗氧化劑可以通過清除體內(nèi)的氧自由基來抑制膿毒性引起的炎性反應(yīng)[24]，而SOD是體內(nèi)唯一可以清除氧自由基和過氧化物的抗氧化酶，其活性水平是機(jī)體抗氧化能力的主要標(biāo)志。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平主要反映體內(nèi)細(xì)胞受到氧自由基攻擊的程度[25]。本試驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)在急性肺損傷模型中，SOD水平顯著下降，而MDA水平明顯升高，表明急性肺損傷引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體的抗氧化能力下降。本結(jié)果表明Osthole可以有效的抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體的抗氧化能力。

據(jù)報道，綠膿桿菌引起的肺部感染導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，是肺部細(xì)胞通透性改變的重要原因[26]，肺炎癥損傷也涉及到細(xì)胞凋亡[14]，為了進(jìn)一步探討Osthole是否對細(xì)胞凋亡也有調(diào)控作用，本研究檢測了肺組織中活性caspase-3的水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性肺損傷中肺部組織活性caspase-3的水平明顯升高，表明急性肺損傷中細(xì)胞凋亡途徑被活化[27-30]。Osthole可以抑制活性caspase-3的水平，表明Osthole可以通過調(diào)控細(xì)胞凋亡來改善急性肺損傷。

綜上所述，本研究以急性肺損傷大鼠為模型，探討研究Osthole對其作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Osthole可以抑制炎性反應(yīng)，緩解肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低肺部細(xì)胞的凋亡，從而減輕肺組織的損傷和通透性的變化，對急性肺損傷大鼠有顯著的保護(hù)效應(yīng)。因此，Osthole對急性肺損傷的作用值得進(jìn)一步的研究，其作用機(jī)制也有待深入的探討。

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