硫代硫酸鈉對尿毒癥老年大鼠血管鈣化的影響

魏 勇 崔美玉 (山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 25002)

心血管疾病在慢性腎臟病患者中的發(fā)病率是健康人的3～6倍，是慢性腎臟病患者的主要死因〔1〕，老年慢性腎臟病患者心血管疾病發(fā)病率更高，其中動脈血管鈣化是慢性腎臟病患者心血管疾病的主要病理生理機(jī)制之一。目前對于慢性腎臟病患者血管鈣化尚無有效的治療方法。硫代硫酸鈉(STS)是一種具有很強(qiáng)抗氧化特性的化合物，對人體無毒性作用，一個世紀(jì)前開始用于氰化物中毒的治療〔2〕，近年來研究證明STS可以減輕卡鉑和順鉑對腎臟的損害〔2～4〕，并且在對鈣化防御的治療中取得了成功〔5，6〕。本研究探討STS是否能夠預(yù)防尿毒癥老年大鼠血管鈣化及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康20月齡雄性Wistar大鼠36只，體重400～500 g，飼養(yǎng)于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。腺嘌呤由Sigma公司提供，STS為上海新亞制藥廠產(chǎn)品，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等指示劑盒購于南京建成生物制品公司。MGP、Fetuin-A ELISA試劑盒購于上海韻涵生物科技有限公司。

1.2 動物模型制備及藥物干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對照組、尿毒癥組、STS組，每組12只大鼠。腺嘌呤加蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%混懸液，每日250～300 mg/kg灌胃，正常對照組用等量蒸餾水灌胃，持續(xù)4 w，4 w后將STS與生理鹽水按1∶3比例配成溶液，按0.4 g/kg給予大鼠腹腔注射，每周3次，持續(xù)6 w。

1.3 標(biāo)本采集 試驗(yàn)第10周注射過量戊巴比妥那處死全部動物，處死前頸動脈取血3 ml，分離血清(－20℃保存?zhèn)溆?，待測生化指標(biāo))，迅速剖開動物取胸主動脈全長，用PBS沖洗后－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血管組織鈣含量測定 取胸主動脈組織1 cm(約10 mg)于80℃烤干，組織稱重，加入2 mmol/L濃硝酸，室溫消化12～24 h，將消化管放于自控電熱消化器上消化至酸全部揮發(fā)，冷卻后用去離子水2 ml充分振蕩溶解過夜，取1.5 ml樣品，加入1%氯化鍶150 μl，用Perkin-Elmer703型原子吸收分光光度計測定422.7 nm波長下的各管A值，自標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出鈣含量，并換算成μmol/g。

1.5 大鼠血MDA、SOD、MGP、Fetuin-A的測定 大鼠腹主動脈取血，靜置，4℃ 2 000 r/min離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書用硫代巴比妥酸(TBA)微量法測定血清MDA含量;用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性。ELISA法測定血Fetuin-A和MGP蛋白水平，每份標(biāo)本測定2次后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組動物血管鈣含量及血清SOD、MDA水平 見表1，STS治療組大鼠血管鈣含量顯著低于尿毒癥大鼠(P＜0.05);與尿毒癥大鼠相比，STS組大鼠血清MDA水平顯著降低、SOD活性明顯提高(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血管鈣含量及血清SOD、MDA水平(±s ，n=12)

表1 各組大鼠血管鈣含量及血清SOD、MDA水平(±s ，n=12)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與尿毒癥組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 血管鈣含量(μmol/g)SOD(IU/mgprot)MDA(nmol/mgprot)正常對照組20±2 20.90±0.97 4.99±0.44尿毒癥組 57±51) 11.47±1.321) 11.54±0.861)STS組 25±32) 17.34±0.682) 7.86±0.342)

2.2 各組動物血漿MGP、Fetuin-A水平 見表2，與正常對照組比較，尿毒癥大鼠MGP、Fetuin-A水平顯著降低;與尿毒癥大鼠組相比，STS組大鼠 MGP、Fetuin-A水平明顯提高(P＜0.05)。

表2 各組動物血MGP、Fetuin-A水平(±s ，n=12)

表2 各組動物血MGP、Fetuin-A水平(±s ，n=12)

組別 MGP(nmol/L) Fetuin-A(ng/ml)正常對照組13.1±1.97 1.86±0.21尿毒癥組 8.6±1.51) 0.46±0.111)STS組 11.5±1.432) 1.31±0.152)

3 討論

慢性腎臟病患者中的血管鈣化較一般人群明顯加速和加重，在慢性腎臟病人群中老年患者血管鈣化發(fā)病率更高〔7～9〕，血管鈣化是慢性腎臟病患者心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的重要危險因素〔10，11〕。近年來最新的證據(jù)表明，血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的主動的調(diào)節(jié)過程，伴隨著血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在這一過程中，氧化應(yīng)激發(fā)揮了重要作用，Parhami等〔12〕指出脂質(zhì)過氧化物具有強(qiáng)的劑量依賴性的促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，Mody等〔13〕的研究表明過氧化氫或黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶能增加細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，這作用能被外源性抗氧化劑所阻斷。氧化應(yīng)激不僅存在于輕-中度腎功能不全患者，在存在于尿毒癥患者〔14〕，血清SOD和MDA的水平可分別從生成過程和生成物兩方面反映體內(nèi)氧自由基的含量，是過氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)。SOD是細(xì)胞內(nèi)一種重要的抗氧化酶，催化O－轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2的歧化反應(yīng)，SOD活力高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力;MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用并因此形成的脂質(zhì)過氧化物，MDA的水平可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映細(xì)胞膜損傷的程度。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，ESRD患者的血管鈣化是由多因素參與的主動的調(diào)節(jié)過程，在這一過程中，促進(jìn)和抑制鈣化的因素尤其鈣化抑制因子的失調(diào)在系統(tǒng)和(或)局部水平起重要作用，鈣化抑制因子包括基質(zhì)Gla蛋白、Fetuin-A等。Fetuin-A是一種主要由肝細(xì)胞分泌的Ca2+結(jié)合蛋白，廣泛存在于細(xì)胞外液，是重要的循環(huán)鈣化抑制劑，一方面可與MGP及鈣磷酸鹽礦物質(zhì)結(jié)合形成循環(huán)蛋白礦物復(fù)合物以防止血管鈣化的發(fā)生，另一方面還可抑制BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)和轉(zhuǎn)化生長因子β的促鈣化作用〔15〕，F(xiàn)etuin-A基因缺陷小鼠能夠發(fā)生以主動脈為主的血管、肺等軟組織鈣化〔16〕。MGP主要由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成及分泌，是骨細(xì)胞成熟的晚期標(biāo)志之一。MGP含有5個羧基谷氨酸(Gla)基團(tuán)，是成骨細(xì)胞的標(biāo)志分子，以維生素K作為輔助因子的γ-谷氨酸羧化酶可將無活性的Gla殘基羧化為有活性的Gla殘基〔17〕。MGP 有抑制血管鈣化的功能，研究顯示〔18〕，MGP基因敲除大鼠主動脈及其分支發(fā)生嚴(yán)重的血管鈣化，后期逐漸發(fā)展為主動脈破裂。另外，MGP能夠與Ca2+結(jié)晶結(jié)合，抑制羥磷灰石結(jié)晶的生長，進(jìn)而抑制血管鈣化。

STS是一種具有很強(qiáng)抗氧化特性的化合物，可與鈣離子形成螯合物，對人體無毒性作用。本文結(jié)果顯示目前對慢性腎臟病患者血管鈣化仍沒有有效地預(yù)防及治療方法。STS可以有效減少鈣在血管壁的沉積，延緩血管鈣化的發(fā)生，尿毒癥確實(shí)可以引起機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，STS可以阻止尿毒癥大鼠血管鈣化的發(fā)生，作用機(jī)制可能是STS通過其抗氧化特性減輕尿毒癥引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)SOD活性，提高機(jī)體抗氧化能力，促進(jìn)自由基清除、抑制或阻斷自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善細(xì)胞內(nèi)皮功能。尿毒癥大鼠血MGP、Fetuin-A等鈣化抑制蛋白明顯降低，是導(dǎo)致血管鈣化的原因之一，STS不僅具有抗氧化作用，而且具有調(diào)節(jié)某些鈣化抑制因子的能力，通過增加鈣化抑制因子的水平，抑制或減輕血管鈣化的發(fā)生。

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