氧化樂果對大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂代謝水平的影響

潘奇正 侯 雪 時佳宏 呂京懋 王 清 孫景春

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

有機磷農(nóng)藥是目前我國使用最多的農(nóng)藥，有機磷酸酯類化合物極易溶解于油脂中并且很少或基本不溶解于水中，易經(jīng)呼吸道、消化道及皮膚吸收進入機體內(nèi)。急性有機磷中毒的主要機制是膽堿酯酶抑制學(xué)說，有機磷可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使機體內(nèi)積累的乙酰膽堿持續(xù)、過度地刺激神經(jīng)系統(tǒng)〔1～3〕。同時由于其良好的脂溶性，有利于其與細胞膜的相互作用，并導(dǎo)致磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的改變，并增強活性氧簇(ROS)的生成量〔4〕;從而破壞機體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡〔5〕，導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激，引起多種疾病如糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔6，7〕;對健康的毒性作用也是極大的，如神經(jīng)毒性、生殖毒性、心血管毒性、內(nèi)分泌毒性等。目前關(guān)于氧化樂果對大鼠脂代謝影響的研究未見報道，機制也不清楚，本實驗觀察氧化樂果對大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平及脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為180～200 g，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(合格證號:2007-003)。氧化樂果，購自河北新興化工有限責(zé)任公司。丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒購自南京建成生物工程研究所;甲醇、正丁醇及氫氧化鉀等試劑購自北京化工廠。

1.2 實驗分組和給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠后，隨機分為正常對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組各10只。低劑量組、中劑量組和高劑量組每天分別給予1/20、1/10、1/5 LD50的氧化樂果，正常對照組給予生理鹽水。采用灌胃的途徑給藥，每日灌胃一次，連續(xù)給藥2個月。每隔2 d稱量一次大鼠體質(zhì)量。

1.3 血清樣本的采集 連續(xù)給藥2個月后，大鼠眼球取血，4℃靜置1 h，4 000 r/min，離心 15 min，取上清液，分裝，－80℃保存待測。

1.4 MDA含量測定 采用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法，脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的MDA可與硫代巴比妥酸形成粉紅色的三甲川(3，5，5-三甲基惡唑-2，4-酮)，三甲川在 534 nm 處有一吸收高峰，利用在534 nm處的消光系數(shù)即可計算出組織中MDA的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 SOD測定 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(·)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出組織中的SOD活力。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.6 CAT測定 CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量，通過計算可測得CAT的活力。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.7 GSH-Px測定 GSH-Px可以促進H2O2與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH-Px的活力可以用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中GSH的消耗，可計算出GSH-Px的活力。同時GSH可以與二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈黃色，在412 nm處測其吸光度即可計算出GSH的量。由于GSH能進行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計算此酶的活力時，必須扣除非酶反應(yīng)引起的GSH減少。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.8 TG、TC和LDL含量測定 取大鼠血清200 μl，應(yīng)用全自動生化分析儀測定大鼠血清中TG、TC、LDL和HDL含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化 隨著氧化樂果暴露時間的持續(xù)，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量增加量減少。給藥2個月時，與正常對照組相比，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05);高劑量組大鼠體重明顯低于低劑量組和中劑量組(P＜0.05)。見圖1。

圖1 氧化樂果連續(xù)給藥2個月大鼠的體重變化

2.2 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的影響 與正常對照組相比較，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠SOD、CAT和GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)，高劑量組大鼠SOD和CAT活性顯著高于低劑量和中劑量組(P＜0.05)。見表1。

表1 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的比較(±s ，U/ml，n=10)

表1 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的比較(±s ，U/ml，n=10)

組別SOD CAT GSH-Px正常對照組1.89±0.04 6.33±0.92 189±3.9低劑量組 1.57±0.04 3.17±0.34 178.3±5.34中劑量組 1.19±0.05 2.04±0.27 142±7.45高劑量組0.83±0.03 0.83±0.33 135.9±9.04

2.3 氧化樂果對各組大鼠脂代謝水平的影響 與正常對照組相比，中劑量和高劑量組大鼠血清TG、TC和LDL含量顯著升高(P＜0.05)，HDL含量顯著降低(P＜0.05)。與中劑量組相比，高劑量組大鼠血清 TG、TC和 LDL含量顯著升高(P＜0.05)，HDL含量顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脂代謝水平比較(n=10，±s，mmol/L)

表2 各組大鼠脂代謝水平比較(n=10，±s，mmol/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與中劑量組比較:2)P＜0.05

組別TG TC LDL HDL正常對照組 0.32±0.015 0.94±0.071 0.27±0.026 1.07±0.035低劑量組 0.35±0.020 0.90±0.052 0.24±0.031 0.96±0.045中劑量組 0.51±0.0261) 1.11±0.0421) 0.38±0.0221) 0.77±0.0131)高劑量組 0.72±0.0231)2)1.36±0.0551)2)0.49±0.0311)2)0.63±0.0671)2)

2.4 氧化樂果對各組大鼠血清MDA水平的影響 與正常對照組〔(456.45±10.23)mmol/L〕相比較，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠 MDA水平〔(523.5±15.3)、(553.4±12.4)、(614.6±9.99)mmol/L〕顯著升高(P＜0.05)，高劑量組大鼠MDA水平顯著高于低劑量和中劑量組(P＜0.05)。

3 討論

氧化樂果是一種脂溶性分子，其可以很容易通過細胞膜進入細胞質(zhì)中，一旦進入可導(dǎo)致各種組織細胞的高度損傷。研究表明，氧化樂果可顯著引起脂質(zhì)過氧化，增強ROS的生成〔8〕。ROS主要攻擊生物分子，而脂質(zhì)對ROS的攻擊最為敏感〔9〕，膜脂的過氧化是組織損傷中一個不可避免的過程，而這有可能損害抗氧化的防御系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化與抗氧化平衡的改變〔10〕。眾所周知，ROS會導(dǎo)致細胞毒性〔11〕。而這一現(xiàn)象可通過觀察脂質(zhì)過氧化反映出來〔12〕。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中不飽和脂肪酸的分解產(chǎn)物，對MDA的測定可以明確反映脂質(zhì)過氧化的程度〔13〕?？寡趸甘钦{(diào)節(jié)機體ROS大量產(chǎn)生的重要酶類，在機體抵抗氧化應(yīng)激的過程中，第一個關(guān)鍵酶是SOD，SOD可催化超氧陰離子(·)與H+的反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)〔14〕;第二個關(guān)鍵酶 CAT催化 H2O2分解為 H2O和，同時 GSH-Px 也參與到分解 H2O2的反應(yīng)中〔16〕，GSH-Px可以促進H2O2與GSH反應(yīng)，生成H2O及GSSG，尤其在較低濃度的 H2O2下〔17〕，GSH-Px是抗氧化應(yīng)激的核心〔18〕。本實驗研究發(fā)現(xiàn)長期接觸氧化樂果能夠?qū)е聶C體發(fā)生脂質(zhì)過氧化，并且機體的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，主要表現(xiàn)在 SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化物酶活性降低。有研究表明有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷暴露的大鼠血脂異常，HDL水平降低，LDL水平增高〔19〕。

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