柱后光化學衍生高效液相色譜法測定調味品中黃曲霉毒素

王韋崗，唐雙雙，陸 源，朱新生

(鎮(zhèn)江市產品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產物，是一種常見的腐生真菌，多見于發(fā)霉的糧食、糧食制品及其他霉腐的有機物中，主要存在形式為B1、B2、G1、G2、M1和 M2。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為一級致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質［1］。研究表明，長期食用被黃曲霉毒素污染的食物將導致肝癌、胃癌、腸癌等疾病。為了防止黃曲霉毒素危害人類健康，世界各國對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量都作了嚴格的規(guī)定［2］。

食醋、醬油、料酒等調味品是以大米、小麥、高粱和黃豆等糧食為主要原料發(fā)酵配制而成的，在原料儲存、發(fā)酵和產品生產過程中容易受到黃曲霉毒素的污染，從而危害人體健康。建立調味品中黃曲霉毒素快速有效的檢測方法是保障食品安全的重要手段之一。目前，常用固相萃取柱［3，4］、免疫親和柱［5，6］和多功能凈化柱［7，8］等對食品樣品中的黃曲霉毒素進行提取和凈化，但由于食醋、醬油等調味品基質復雜，所以單一的凈化方法并不能滿足檢測要求。本文介紹了采用中性氧化鋁固相萃取柱結合MycoSep 228 AflaPat多功能凈化柱來凈化樣品，應用光化學衍生和高效液相色譜法同時測定調味品中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的方法，為實驗室開展黃曲霉毒素的檢測提供了簡便、有效的方法。

1 材料與方法

1．1 儀器及設備

Waters e2695高效液相色譜儀(主要包括2475熒光檢測器，柱溫箱，自動進樣器，自動脫氣四元梯度泵等);光化學衍生器;氮氣吹干儀;Millpore超純水系統(tǒng);C18、弗羅里硅土、硅膠、中性氧化鋁和石墨化碳黑固相萃取柱;多功能凈化柱(MFC):MycoSep 228 AflaPat(美國Romer Labs)。

1．2 試劑

黃曲霉毒素標準品(Supelco，美國):G1、G2和B2的質量濃度為 2 μg/mL，B1的質量濃度為1.12 μg/mL，M1的質量濃度為 10 μg/mL。用甲醇配成含 40 ng/mL B1、G1和 M1，20 ng/mL B2和 G2的標準儲備溶液，保存于－20℃冰箱中;亞鐵氰化鉀和硫酸鋅為分析純，甲醇和乙腈為色譜純;實驗用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得，18 MΩ·cm，25℃。

1．3 儀器分析條件

色譜柱:Symmetry ShieldTMRP18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 ∶乙腈 ∶水 =25 ∶20 ∶55;流速:0.8 mL/min;進樣體積:20 μL;柱溫:30 ℃;熒光檢測器:激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長430 nm。

1．4 樣品處理

稱取2 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL容量瓶中，分別加入1 mL亞鐵氰化鉀(10.6%)溶液和1 mL硫酸鋅(30%)溶液，搖勻后用乙腈-水混合溶液(體積比為80∶20)定容，靜置沉淀30 min;移取10 mL上清液至中性氧化鋁固相萃取柱內，并收集濾液至多功能凈化柱的玻璃試管中，用MycoSep 228 AflaPat多功能凈化柱對樣品進一步凈化;移取1 mL凈化液于另一玻璃試管中，經60℃ 加熱氮氣吹干，再加入1 mL流動相溶解混勻，經0.45 μm濾膜過濾后進樣分析。

2 結果和討論

2．1 提取方法的選擇

黃曲霉毒素難溶于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑，而乙腈由于具有滲透性好、提取率高等優(yōu)點，成為黃曲霉毒素常用的提取溶劑。雖然黃曲霉毒素難溶于水，但是提取液中少量的水可以潤濕基質，增強有機溶劑在樣品中的滲透力，因此，采用有機溶劑與水的混合溶液作為提取液，可以提高樣品的提取效率。食醋、醬油等調味品一般由糧食發(fā)酵而成，含有大量的有機酸、氨基酸、糖分等大分子物質，成分復雜，若直接稀釋進樣，不但干擾物質較多，而且容易引起柱壓升高，柱效下降，影響黃曲霉毒素的檢測。在實驗中發(fā)現(xiàn)，亞鐵氰化鉀和硫酸鋅可以沉淀大部分干擾物質，得到的提取液相對干凈，有利于下一步實驗條件的優(yōu)化。

2．2 固相萃取柱的選擇

調味品中通常含有焦糖色、紅曲紅等色素，經過亞鐵氰化鉀和硫酸鋅沉淀后的樣品提取液顏色較深，因此需要進一步凈化。通過實驗，比較了C18、弗羅里硅土、硅膠、中性氧化鋁和石墨化碳黑固相萃取柱對調味品中黃曲霉毒素的凈化效果，結果表明:C18、弗羅里硅土和硅膠固相萃取柱對調味品中色素的祛除能力較差，且凈化后雜質峰較多，會對黃曲霉毒素M1和G2的測定產生干擾;中性氧化鋁和石墨化碳黑固相萃取柱對樣品中的色素均有很好的吸附作用，但石墨化碳黑固相萃取柱在吸附色素的同時也吸附了樣品中的黃曲霉毒素，影響了黃曲霉毒素的回收率。因此，本實驗中使用中性氧化鋁固相萃取柱對樣品提取液進行脫色。

2．3 凈化方法的選擇

沉淀劑和中性氧化鋁固相萃取柱雖然能祛除樣品中的大部分有機物及色素，但由于調味品成分復雜，基質干擾大，且通常樣品中黃曲霉毒素的含量較低，因此需要充分凈化樣品，以減少雜質對黃曲霉毒素測定的干擾。在上述實驗基礎上，采用美國Romer Labs公司的MycoSep 228 AflaPat多功能凈化柱，對樣品中的黃曲霉毒素進一步分離純化。多功能凈化柱是一種特殊的固相萃取柱，其填料中含有親脂性(非極性)和電荷活性(極性)成分，可有選擇地吸附樣品提取液中的脂類、蛋白質和碳水化合物等干擾物質，讓待測化合物通過凈化柱，從而達到分離純化的目的。圖1是調味品樣品采用不同方式處理后的色譜圖。

圖1 空白調味品樣品采用不同方式處理后的色譜圖

2．4 線性范圍和檢出限

吸取適量體積黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的標準儲備溶液，用甲醇稀釋配成相應濃度的混合標準溶液，并按選定的色譜條件進行分析。結果表明，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的質量濃度與其峰面積呈良好的線性關系，其相關系數為0.9994～0.9999，相應的線性回歸方程見表1。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程和方法檢出限

在空白樣品中加入標準品，按上述方法處理樣品，根據3倍信噪比(S/N)峰的響應值，得到黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的最低檢出限分別為0.50 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg、0.10 μg/kg和0.50 μg/kg。混合標準溶液及調味品加標樣品的色譜圖見圖2。

圖2 (a)混合標準溶液和(b)調味品加標樣品的色譜圖

2．5 回收率和精密度

選取黃曲霉毒素含量低于檢出限的空白食醋、醬油、糖醋汁和調味料酒樣品，在樣品中分別按0.50 ng/mL加入B2和G2標準溶液，按1.50 ng/mL加入B1、G1和M1標準溶液，并以上述實驗方法進行樣品處理和測定，考察實驗方法的回收率，對加標樣品重復測定6次，考察實驗方法的精密度。結果表明，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的回收率均在85%以上，相對標準偏差(RSD)為1.27% ～4.82%。回收率和精密度結果見表2。

表2 樣品中黃曲霉毒素加標回收率和精密度實驗結果(n=6)

3 結論

本研究采用亞鐵氰化鉀和硫酸鋅沉淀調味品中蛋白質等干擾物質，經中性氧化鋁固相萃取柱脫除提取液中的色素，并結合多功能凈化柱和柱后光化學衍生技術測定調味品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的含量，該方法具有簡便、快速、溶劑消耗少、回收率高等優(yōu)點，為調味品中黃曲霉毒素的檢測提供了實用的技術手段。

［1］柳潔，何碧英．黃曲霉毒素高效液相色譜檢測方法研究進展［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15(7):891 －896．

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