大鼠肝癌細胞與胚胎肝細胞的microRNA差異表達譜分析

吳印濤，邱寶安

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100036)

MircoRNAs (miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，長20～24 nt。它是由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長約70～80 nt的單鏈RNA 前體經(jīng)過Dicer 酶加工后生成［1］。異常的miRNAs 表達可能與人類許多疾病乃至腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)［2～5］。原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、預(yù)后差、病死率高，主要死因是肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［6，7］。近年研究表明，miRNAs 在正常肝組織及肝癌組織中的表達明顯不同，且多數(shù)miRNAs 基因位于與腫瘤形成相關(guān)性脆弱基因的位點，它可能參與了肝細胞癌變的病理過程［8］。2007～2010年，我們檢測了大鼠肝癌細胞和大鼠胚胎肝細胞中miRNAs 表達差異譜，旨在為進一步研究miRNAs 在HCC 發(fā)生機制中的調(diào)控作用提供有益的新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝癌細胞來自本實驗室培養(yǎng)的F334 大鼠原代肝癌細胞系，大鼠胚胎肝細胞來自本實驗室培養(yǎng)的F334 大鼠原代胎肝細胞系。細胞總RNA 抽提試劑Trizol (Invitrogen 公司)，標記試劑盒、芯片雜交試劑盒、miRNA 芯片洗染試劑盒等(Exiqon 公司)。Agilent G2505B 型掃描儀，Genepix軟件以及SAM 3.0 軟件數(shù)據(jù)分析軟件(Exiqon 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HCC 模型的建立 取體質(zhì)量150～200 g 雄性近交系F334 大鼠150 只，隨機分為實驗組和對照組各75 只，實驗組飼以含二乙基亞硝胺(0.15% DEN)飲水，連續(xù)12 周后改為自由飲水。對照組常規(guī)自由飲水。12 周后，實驗組大體解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)地較硬、滿布大小不等的癌結(jié)節(jié)(圖1 A)。HE 染色結(jié)果符合HCC 病理改變，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，各種異常的肝細胞構(gòu)成增生結(jié)節(jié)，并且伴有纖維結(jié)締組織增生(圖1 B)。原代接種24 h 后可見由3～5個細胞組成的上皮樣細胞克隆，7 d 后發(fā)現(xiàn)由大量細胞形成穩(wěn)定的克隆團塊，形態(tài)呈多邊形，邊緣清晰明確(圖1 C)。

圖1 大鼠HCC 模型及細胞原代培養(yǎng)

1.2.2 原代培養(yǎng) 取大鼠肝癌組織及胚齡14 d 大鼠胚胎肝臟組織，將其剪成1 mm3左右的小塊，放入三角燒瓶中，加入40 倍體積的膠原酶，密封燒瓶。將燒瓶放入37 ℃的恒溫振蕩水浴箱中，消化20 min，待組織完全分散后(如組織塊較大未充分消化可用100 目鋼網(wǎng)過濾)，1 000 r/min 離心，5 min 后，去除上清，用Hank's 液離心漂洗1～2 次，去除上清，加William's E 培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。注意及時觀察換液，待細胞生長覆蓋瓶底80%時，在顯微鏡下挑取單克隆細胞島進行傳代擴增。

1.2.3 RNA的提取、分離和標記 大鼠肝癌細胞和大鼠胚胎肝細胞用含10%胎牛血清的William's E 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。經(jīng)傳代培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期、80%融合狀態(tài)時收獲107細胞。Trizol 一步法提取細胞中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用紫外分光光度計定量，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA 樣本的質(zhì)量。肝癌細胞中提取總RNA 63.48 μg，胚胎肝細胞中提取總RNA 83.57 μg。根據(jù)RNA 在A260/280 值≥1.7，以及甲醛變性凝膠電泳28 s、18 s rRNA，條帶清晰，亮度比值接近2∶1，滿足miRNA 芯片實驗的要求。然后，取0.25～1 μg 總RNA 利用Hy3 進行熒光標記，待溶液完全溶解無沉淀后可進行芯片雜交。

1.2.4 基因芯片的雜交、清洗和掃描 將帶有熒光標記的RNA 溶于400 μL 雜交液中，滴加到Agilent的蓋片上，于56 ℃轉(zhuǎn)動雜交16 h。雜交結(jié)束后，于56 ℃分別在Wash buffer A 、Wash buffer B 及Wash buffer C 中各洗滌2 min，而后在裝有無RNAase 水的液體中漂洗1 s，最后200 g 離心5 min 干燥。芯片使用Agilent G2505B 型掃描儀進行圖像掃描，得到芯片雜交圖譜。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 將雜交圖譜在Genepix 軟件中打開，根據(jù)芯片名稱及研究物種，導入相應(yīng)的GAL(Genepix Arrat List)文件，將陣列模板與芯片圖譜中的陣列逐樣點對應(yīng)起來，抓取信號數(shù)據(jù)，再對實驗數(shù)據(jù)使用SAM3.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

miRNA 在大鼠肝癌細胞與胚胎肝細胞中的差異性表達見圖2。與大鼠胚胎肝細胞相比，有78個miRNAs 在肝癌細胞中有表達差異，包括68個表達上調(diào)和10個表達下調(diào)。部分下調(diào)表達差異較為顯著的miRNAs 見表1。

表1 部分下調(diào)表達差異較為顯著的miRNAs

3 討論

圖2 SAM 軟件分析結(jié)果

miRNA 是一種廣泛存在于真核生物中，大小為20～24 nt的小分子單鏈非編碼的RNA，其進化過程高度保守，并且在細胞中呈明顯的時序性表達模式，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)節(jié)，參與細胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學過程［9］。多數(shù)miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性［10，11］，雖然這些miRNAs的生物學功能目前還不十分清楚，但是miRNA的調(diào)控作用很可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它需要接受某些信號的刺激，從整體上調(diào)控有機體的生命活動［12，13］。大量研究證據(jù)表明，miRNAs 在HCC的進展中發(fā)揮著重要的作用，并且直接參與了肝癌細胞的分化、凋亡、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。miRNAs 是通過與其靶mRNA 分子的3'端非編碼區(qū)互補結(jié)合，形成RNA 誘導的沉默復(fù)合體［14］，然后作用于靶點mRNA，通過對mRNA 剪切或抑制翻譯過程而調(diào)節(jié)基因的表達［15］。miRNA 與靶mRNA 完全互補時，mRNA 將發(fā)生特異性降解;兩者不完全互補時，抑制了mRNA的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)情況兩者并不完全互補，所以其主要作用模式是轉(zhuǎn)錄后的翻譯阻遏。miRNA的作用具有多相性，一個miRNA 可以調(diào)節(jié)多個基因，一個基因也可受多個miRNA的調(diào)控，從而形成復(fù)雜而又精準的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控著生物體的基因表達及功能，一旦其表達水平失衡，將導致疾病的發(fā)生。

本試驗采用哺乳動物miRNA 芯片技術(shù)篩選出大鼠肝癌細胞與胚胎肝細胞差異表達的miRNAs，其證實的調(diào)節(jié)靶基因包括有參與蛋白質(zhì)合成與水解、細胞周期、細胞增殖、細胞分化與凋亡、信號傳導與轉(zhuǎn)錄、離子束縛、物質(zhì)代謝等生物生命進程中的多個基因，其涉及到腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個方面，說明某些關(guān)鍵的miRNAs 表達水平的失衡是HCC 發(fā)生和演進的重要分子改變。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大鼠肝癌細胞中上調(diào)的miRNAs 與下調(diào)的比值約為68∶10，提示大鼠肝癌細胞中的癌基因、抑癌基因共同作用，相互協(xié)調(diào)，從而導致了細胞癌變的發(fā)生。

miR-122 是一種肝臟發(fā)育的肝特異性miRNA，占成年肝臟miRNA 表達總量的70%左右，且不同物種間的表達具有高度進化保守性［16］。本研究利用生物信息學方法預(yù)測此miRNA 在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-122 與細胞周期素(CCNG1)、抗凋亡蛋白Bcl-w、解聚素—金屬蛋白酶(ADAM17)關(guān)系密切。Gramantieri 等［17］研究認為，miR-122 通過抑制CCNG1的表達達到維持染色體穩(wěn)定、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，在HCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演著腫瘤抑制物的角色。眾所周知，Bcl-2 蛋白家族在調(diào)控線粒體凋亡信號上有非常重要的作用。Lin 等［18］發(fā)現(xiàn)，miR-122 以Bcl-w 為直接靶點，介導內(nèi)源性凋亡通路，激活細胞凋亡蛋白3，從而促進凋亡的發(fā)生。ADAM17 參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，其表達沉默可使肝癌細胞在體外遷移和轉(zhuǎn)移能力、在體內(nèi)血管生成及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力急劇下降［19］。miR-122 可通過抑制ADAM17的表達而抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，因此可認為miR-122 起到了抑癌基因的作用。

上述研究結(jié)果表明，miRNAs 在胎肝細胞向肝癌細胞的轉(zhuǎn)變過程中扮演著十分重要的角色，類似于癌基因和抑癌基因的作用，這就有可能為闡明肝細胞癌變的分子機制提供一條新的思路。Li 等［20］對120例HCC 患者血清miRNA 表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)利用異常表達的miR-375 診斷HCC 特異度達96%，敏感度達100%。我們設(shè)想，如果能夠獲得一種miRNA 穩(wěn)定表達的途徑，如血液、唾液等，那么液相芯片技術(shù)將因其具有高通量、方便、快速與經(jīng)濟的特點，極可能成為一種大規(guī)模診斷腫瘤的方法。由于HCC 是多基因疾病，針對多個HCC 過度表達的基因設(shè)計特異性miRNA，同時多靶點沉默多個癌基因、多靶點作用于信號通道和分子靶點，從而達到全面的治療效果，這無疑也將成為HCC 靶向治療新的研發(fā)方向。

總之，本研究利用miRNA 芯片技術(shù)和生物信息學的方法，篩選出大鼠肝癌細胞和胚胎肝細胞miRNA的差異表達譜，為進一步研究miRNAs 在肝細胞癌變分子機制中的調(diào)控作用提供了有用的數(shù)據(jù)庫，而對篩選出的差異miRNAs 進行驗證和功能學的研究則是下一步開展的工作。同時結(jié)合臨床上不同的HCC 病理類型、惡性程度、分期、分級等特征，研究其miRNAs的差異表達譜，是否能成為HCC的個體化治療及判斷愈后的重要指標將是本實驗室未來的研究方向。

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