眼針療法對D-IBS模型大鼠結(jié)腸VIPR1表達的影響

王德山 王艷杰 劉慧慧 劉旭東 柴繼嚴 趙金茹 (遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 0032)

由我國著名針灸學家彭靜山教授創(chuàng)立的眼針療法，在防治腸易激綜合征等胃腸道功能性疾病方面療效顯著，但是其作用機制目前尚不清楚。本實驗觀察了眼針對腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠模型血清、結(jié)腸組織VIP含量及VIP-R1的表達影響，為眼針防治D-IBS作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 SPF級雄性Wistar大鼠30只，體重(220±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2007-0001。分籠飼養(yǎng)，標準顆粒飼料喂養(yǎng)7 d以后按隨機數(shù)字法分為:對照組、模型組和眼針組，每組10只。

1.2 IBS模型建立與評價指標 在 Katz和 Williams等〔1，2〕方法基礎上，采用慢性應激刺激與束縛結(jié)合方法建立D-IBS模型〔3〕。IBS成模評價指標:①依據(jù)一般狀態(tài)、排便粒數(shù)與結(jié)腸轉(zhuǎn)運功能;②大鼠的腹部回縮反射(CRD)半定量評分;③結(jié)腸組織形態(tài)學觀察。

1.3 眼針刺激方法 通過D-IBS評價標準確定模型復制成功后，眼針組給予眼針刺激，取穴參照人體取穴定位法分別取:下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)〔3〕;刺法:用31號13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺;手法:平刺，進針3 mm，留針20 min。每12 h刺激1次，連續(xù)針刺7 d。模型組只進行束縛處理，對照組不給予刺激。

1.4 結(jié)腸轉(zhuǎn)運功能測定 造模的第18天和眼針治療后，大鼠禁食24 h，以30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，用膠帶束縛大鼠前肢，取直徑為3 mm的玻璃小球放入距肛門3 cm的直腸內(nèi)。大鼠蘇醒后迅速移至籠內(nèi)喂食飲水，籠內(nèi)鋪墊清潔濾紙。觀察1 h內(nèi)大鼠排便的糞點數(shù)和玻璃小球排出時間。

1.5 內(nèi)臟敏感性評估 采用腹部回縮反射(AWR)測定法。實驗前禁食12 h，乙醚麻醉狀態(tài)下將帶有球囊的導尿管置入距肛門內(nèi)1 cm處并固定于尾部，將大鼠限制在特制的透明塑料籠(20 cm×6 cm×8 cm)內(nèi)，只能前后運動而不能轉(zhuǎn)身。清醒30 min后向球囊內(nèi)分別注入容量為1.0、1.5、2.0 ml溫水擴張結(jié)、直腸 (CRD)，每一容量擴張持續(xù)時間為20 s，間隔30 s;重復3次。根據(jù)腹部回縮反射評分標準進行AWR評分，取3次評分的平均值。分值越高為內(nèi)臟敏感性越強。

大鼠AWR評分標準〔4〕:0分:大鼠對結(jié)腸擴張時無行為反應;1分:結(jié)腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少;2分:結(jié)腸擴張時腹肌收縮但未抬離桌面;3分:結(jié)腸擴張時腹肌收縮并抬離桌面;4分:結(jié)腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓狀。

1.6 結(jié)腸組織病理學觀察 手術(shù)取距肛門上10 cm處取結(jié)腸全層組織，常規(guī)用HE染色，光鏡觀察組織病理學變化。

1.7 血清和結(jié)腸組織中VIP含量的測定 眼針結(jié)束后，麻醉后腹主動脈取血3 ml，分離血清供檢測用;取盲腸上結(jié)腸組織，清理干凈后按1∶9加入預冷生理鹽水制備勻漿，離心取上清，按照試劑盒說明書進行ELISA檢測。利用全自動酶標儀，在450 nm處測定各孔的OD值，采用Curve Expert 1.3進行標準曲線的繪制，并計算出對應的濃度值。

1.8 結(jié)腸組織中VIP-R1的mRNA與蛋白表達檢測 Trizol及RT-PCR試劑盒、引物由大連寶生物工程提供。VIP-R1基因表達采用二步法進行RT和PCR操作，利用Trizol試劑進行總RNA的提取，以紫外分光光度計測量吸光度，記錄OD260及OD280值，二者比值即為總RNA純度。取OD260/OD280在1.8～2.0之間的RNA按照RT試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板在25 μl體系中進行PCR擴增。反應條件為 94℃預變性 2 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃30 s，共 30 個循環(huán);72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后，利用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描和分析擴增帶，與內(nèi)參β-actin比較，得到VIP-R1 mRNA的相對表達強度。參照SABC試劑盒說明書進行免疫組化法檢測結(jié)腸組織中VIP-R1蛋白表達。應用BI-2000圖像分析系統(tǒng)，隨機選取每張切片的3～5個視野，×200光鏡下測定陽性細胞的平均光密度值，平均光密度值代表陽性表達參數(shù)，平均光密度值越大，陽性表達越強。

2 結(jié)果

2.1 眼針對D-IBS模型大鼠一般狀態(tài)的影響 在本實驗過程中無動物死亡。與對照組比較，模型制備過程中大鼠毛色漸晦暗、進食和活動減少，體形消瘦;表現(xiàn)極度煩躁，出現(xiàn)躲避、畏懼、嘶叫、互相對峙、甚至扭打撕咬等易激惹表現(xiàn);排便次數(shù)明顯增多，便質(zhì)變軟變稀，糞點不成型;排出玻璃小球時間明顯縮短;大鼠AWR評分均明顯增高;顯微鏡下大鼠結(jié)腸組織各層無白細胞浸潤，間質(zhì)有水腫。根據(jù)成模標準D-IBS大鼠模型復制成功。經(jīng)過眼針治療后，與模型組比較，眼針組大鼠表現(xiàn)為活潑好動，毛發(fā)光澤，體重增加，激惹及輕度好斗傾向緩解。小球排出時間延長，排便次數(shù)和大便粒數(shù)明顯減少而成型、便質(zhì)逐漸恢復正常(圖1)。

AWR用于檢測大鼠內(nèi)臟敏感性實驗，其結(jié)果如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠在1.0、1.5、2.0容量擴張下AWR評分均顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，眼針組AWR評分則明顯降低(P＜0.05)，表明眼針能夠降低D-IBS模型大鼠內(nèi)臟敏感性。

2.2 眼針對D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織中VIP含量的影響 如表1所示，各組血清中VIP含量變化均高于結(jié)腸組織值。與對照組比較，模型組和眼針組大鼠血清VIP水平均升高(P＜0.01)，尤以模型組升高顯著(P＜0.01);眼針組的結(jié)腸組織中VIP含量明顯低于模型組(P＜0.05)，與對照組沒有顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 眼針對D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)的影響

圖2 眼針對D-IBS模型大鼠AWR評分的影響

表1 眼針對D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織VIP含量的影響(n=10，±s，ng/L)

表1 眼針對D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織VIP含量的影響(n=10，±s，ng/L)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 血清 結(jié)腸組織對照組3.09±1.65 2.812±0.112模型組 10.46±3.331) 4.258±0.3111)眼針組 5.63±2.331)2) 2.902±0.2351)2)

2.3 眼針對D-IBS大鼠模型結(jié)腸組織中VIP-R1表達的影響

應用免疫組化方法檢測觀察到，上皮組織由吸收細胞和杯狀細胞組成，VIP-R1蛋白陽性物表達部位主要在結(jié)腸黏膜上皮組織中，呈棕黃色反應(圖3)。與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織VIP-R1陽性反應呈現(xiàn)出密集的表達，與模型組(0.351±0.024)比較，眼針組 VIP1-R陽性表達(0.265±0.010)均顯著降低(P＜0.05)，與對照組(0.232±0.012)比較差異顯著(P＜0.01)。結(jié)腸組織中VIP-R1 mRNA表達檢測結(jié)果如圖4所示，與對照組(0.742±0.130)比較，模型組VIP-R1 mRNA的表達(1.522±0.278)明顯上調(diào)(P＜0.05)，其變化趨勢與VIP含量改變一致。經(jīng)過眼針刺激，眼針組VIP-R1 mRNA的表達量(0.440±0.201)與模型組比較則明顯下調(diào)(P＜0.05)。提示眼針對D-IBS模型大鼠結(jié)腸中VIP-R1 mRNA高表達具有抑制作用。

圖3 眼針對D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織中VIP-R1蛋白表達影響(DAB，×400)

圖4 眼針對D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織中VIP-R1 mRNA表達結(jié)果影響

3 討論

IBS是以腹痛或腹部不適，伴有大便形狀和排便習慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ芪蓙y性腸道疾病，臨床檢查多無明顯器質(zhì)性和異常的生化指標變化。目前臨床多傾向于以羅馬Ⅲ標準進行分型，該分型主要以糞便中含水量為重要依據(jù)，其中尤以腹瀉型占據(jù)比例最大〔5，6〕。關于D-IBS發(fā)病機制仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)D-IBS患者結(jié)腸黏膜上皮細胞水通道蛋白(AQPs)表達發(fā)生明顯改變〔7～9〕，提示與結(jié)腸組織水分子的轉(zhuǎn)運功能異常而導致了內(nèi)臟高敏感性有關。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠除了一般狀態(tài)出現(xiàn)各種類似人類的焦躁、抑郁等精神神經(jīng)性改變外，其腹瀉、大便中含水量均多于正常組，同時伴有AWR分值升高，支持了D-IBS狀態(tài)下結(jié)腸水分子轉(zhuǎn)運功能異常與內(nèi)臟高敏感性存在的觀點。

AQPs是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞膜內(nèi)外轉(zhuǎn)運水分子的關鍵性蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分布在消化道，特別是結(jié)腸組織的AQPs類型與數(shù)量多而廣泛，其中以AQP3和AQP8與結(jié)腸水分子轉(zhuǎn)運功能關系最為密切。實驗證實D-IBS患者大便含水量增多，排便頻率增加，是由于結(jié)腸黏膜上皮細胞AQPs的表達下調(diào)所致〔7，8〕。對于AQPs表達的調(diào)控研究表明，VIP是調(diào)控人結(jié)腸上皮細胞AQP8表達的主要腦-腸肽物質(zhì)之一〔10〕，并發(fā)現(xiàn)D-IBS患者以及脾虛腹瀉動物等血和結(jié)腸組織中VIP水平均升高〔11～13〕，從而支持了D-IBS狀態(tài)下的腹瀉發(fā)生機制可能與VIP分泌增加影響了AQPs表達的推測。

VIP受體是介導VIP信息傳遞的靶標蛋白分子，VIP信息傳遞所引起的生物效應不但取決于血清及組織中含量，而且與VIP受體在靶細胞表達量有著直接關系。VIP受體(VIP-R)已經(jīng)被克隆出3個亞型，屬于G蛋白耦聯(lián)型受體〔14〕，分布在消化道的VIP受體分為VIP-R1和VIP-R2兩種亞型，其中VIP-R1表達部位主要在結(jié)腸黏膜上皮細胞上，VIP-R1與VIP具有高親和力。VIP與VIP-R1結(jié)合后激活G蛋白耦聯(lián)受體，可能通過cAMP-PKA跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑影響了AQPs的表達〔15〕。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清、結(jié)腸組織中不但VIP含量顯著增加，而且結(jié)腸組織細胞上VIP-R1表達也明顯上調(diào)。由此認為，D-IBS狀態(tài)下由于體內(nèi)VIP過量分泌與釋放的同時，結(jié)腸組織細胞上的VIP-R1高表達是加劇了VIP的病理生理效應又一重要原因。由于VIP含量增高及VIP-R1的高表達則影響了AQPs表達，進而降低了結(jié)腸內(nèi)水液的轉(zhuǎn)運能力，導致了內(nèi)臟敏感性增加。

眼針療法是彭靜山教授依據(jù)中醫(yī)學經(jīng)典臟腑、經(jīng)絡等理論，運用五輪、八廓以及八卦學說，并結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗所創(chuàng)立的一種微針療法〔16〕。是將眼睛周圍按照八卦分為八區(qū)十三穴，而對應人體相應的五臟六腑、器官組織等。通過辨證選取相應的穴位進行針刺而達到治療全身不同部位疾病的目的。本實驗運用眼針方法選取相應穴位進行刺激后，在D-IBS大鼠一般狀態(tài)得到恢復，以及腹瀉癥狀得到控制的同時，其血清和結(jié)腸組織VIP水平出現(xiàn)明顯下降，結(jié)腸組織細胞上VIP-R1的蛋白與基因表達也出現(xiàn)明顯的下調(diào)。提示了眼針治療D-IBS腹瀉和內(nèi)臟高敏感性的機制之一，可能與抑制血中、結(jié)腸組織中VIP過量分泌與釋放，同時下調(diào)結(jié)腸相關細胞上VIP-R1的表達有關。由于VIP含量下降和受體表達下調(diào)則減輕或解除了對AQPS影響，使結(jié)腸內(nèi)水液轉(zhuǎn)運功能得以恢復，并降低內(nèi)臟敏感性的異常，而達到了治療D-IBS的效果。

在本實驗中，眼針對于血清，特別是對結(jié)腸組織中VIP含量、VIP-R1受體表達的影響途徑，VIP對結(jié)腸組織細胞上何種類型AQPS表達進行影響，以及是否還通過其他信號轉(zhuǎn)導途徑對AQPS進行影響等，均有待于進一步研究證實。無疑，闡明這些問題將對眼針治療D-IBS的機制將會提供更多依據(jù)。

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