腦脊液中Th17細(xì)胞相關(guān)因子對(duì)脫髓鞘疾病鑒別診斷的意義

劉 力 何紅美 康熙雄 (石家莊市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊050000)

脫髓鞘疾病是中樞和外周神經(jīng)纖維剝脫導(dǎo)致的一系列疾病。最常見(jiàn)的為多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)，還包括一些具有炎性脫髓鞘臨床及MRI改變的尚不能確診的神經(jīng)疾病。多發(fā)性硬化具有時(shí)間多發(fā)性和空間多發(fā)性的特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)與其他神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病很相似，鑒別診斷缺乏良好的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

Th17細(xì)胞是近些年關(guān)注較多的參與自身免疫性疾病的效應(yīng)細(xì)胞，可分泌特異性IL-17A，在免疫炎癥演變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Th17活化及分泌行為受某些細(xì)胞因子的影響，如IL-6、TGF-β刺激Th17分化，而IL-21、IL-23維持Th17細(xì)胞增殖，并促進(jìn)IL-17A的分泌［1］。由于各因子在免疫病理不同階段發(fā)揮作用，因此，綜合應(yīng)用Th17細(xì)胞相關(guān)的上游和下游因子來(lái)評(píng)價(jià)脫髓鞘疾病的免疫炎癥狀態(tài)可能為鑒別診斷脫髓鞘疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 病例選擇 選擇2011年1月～8月北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科入院患者，其中復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(MS)患者25例，臨床診斷符合2005年新修訂的Mcdonald診斷標(biāo)準(zhǔn)。炎性脫髓鞘病(Inflammatory demyelinating diseases，IDDs)患者21例。以上兩組排除嚴(yán)重心肝腎疾病、其他自身免疫病、急慢性感染及急性腦梗塞。病例對(duì)照組(Control cases，CCs)患者7例，分別為特發(fā)性高顱內(nèi)壓(2例)、癲癇(2例)、單純性頭痛(1例)、顱內(nèi)靜脈血栓(1例)、副腫瘤綜合征(1例)?；颊呷齻€(gè)月內(nèi)未接受任何糖皮質(zhì)激素和其他免疫調(diào)節(jié)劑治療。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 收集患者臨床信息，包括性別、年齡、病程、發(fā)作次數(shù)等。

1．2．2 標(biāo)本留取 患者入院第二天，抽取腦脊液、全血送檢。檢驗(yàn)項(xiàng)目包括腦脊液常規(guī)、24小時(shí)鞘內(nèi)IgG合成率、寡克隆區(qū)帶等臨床免疫學(xué)指標(biāo)。

1．2．3 液體芯片技術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-21、IL-23 采用流式-熒光液體芯片試劑及Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀。試劑盒為美國(guó)Millipore細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(MPXHCYTO-60K-04:IL-17A，IL-6，TNF-α;MPXHCYP2-62K-02:IL-21，IL-23)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，設(shè)定空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)各計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，符合正態(tài)分布的兩組均數(shù)之間差別的比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料和百分比等計(jì)數(shù)資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用非參數(shù)U-Mann-Whitney檢驗(yàn)比較兩組獨(dú)立樣本的差異。P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組臨床免疫學(xué)項(xiàng)目比較 各組基本信息及血腦屏障完整性、寡克隆區(qū)帶檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。其中年齡、性別比例、白蛋白指數(shù)均無(wú)顯著差異。而MS組和IDDs組的血腦屏障受損比例、24小時(shí)鞘內(nèi)IgG合成率及寡克隆區(qū)帶陽(yáng)性率顯著高于CCs組，MS與IDDs組之間無(wú)顯著差異。此結(jié)果符合免疫性脫髓鞘疾病的實(shí)驗(yàn)室改變［2］。

2．2 MS組細(xì)胞因子顯著升高 比較各組腦脊液中細(xì)胞因子水平的差異。結(jié)果顯示，MS組(P=0.025)和IDDs(P=0．044)組IL-17A均顯著高于CCs組;MS組與IDDs組比較，差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MS組 TNF-α顯著高于 IDDs組和CCs組(均P＜0．01)，IDDs組與 CCs組無(wú)顯著差異。IL-6和IL-21在各組之間無(wú)顯著差異。見(jiàn)表2。

2．3 IL-17A診斷 MS的ROC曲線 將CCs組和MS組腦脊液中IL-17A建立ROC曲線(P=0．026)，曲線下面積為0．780，當(dāng) IL-17A濃度為6．5 pg/ml時(shí)，特異度與靈敏度之和最大，對(duì)MS的診斷價(jià)值最高。

2．4 MS組IL-23顯著升高 CCs組只有1例標(biāo)本檢測(cè)出IL-23水平，并且含量較低。MS組和IDDs組各有10例標(biāo)本可檢測(cè)出IL-23。被檢測(cè)出的樣本分析顯示，MS組 IL-23顯著高于 IDDs組(P=0.005)。見(jiàn)表2。本研究亦針對(duì)MS患者病程與IL-23水平做相關(guān)性分析，并未得出陽(yáng)性結(jié)果。鑒于IL-23在Th17活化后期發(fā)揮作用［8］，推測(cè) IL-23表達(dá)可能與疾病病程和發(fā)作次數(shù)有關(guān)，對(duì)于鑒別診斷MS及IDDs具有一定的意義。

表1 各組臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果Tab．1 Results of routine clinical items in every group

表2 各組Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平Tab．2 Cytokines associated with Th17 lymphocyte in every group

2．5 MS組腦脊液中IL-17A與IL-23呈正相關(guān) 將MS組CSF中IL-17A與IL-23做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù) r=0．648，說(shuō)明二者具有相關(guān)性(P=0．043)。

3 討論

免疫炎癥是神經(jīng)脫髓鞘疾病重要的病理機(jī)制，多種免疫細(xì)胞和免疫分子參與其中。Th17是近年來(lái)研究參與自身免疫性疾病的效應(yīng)細(xì)胞，血液和腦脊液均可檢測(cè)到較低比例的Th17細(xì)胞。Th17分泌的特征性細(xì)胞因子IL-17A是重要的炎癥介質(zhì)，多種自身免疫性疾病患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清及病變組織中分離出的單個(gè)核細(xì)胞均高表達(dá)IL-17A，且外周血和病灶處IL-17A水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。MS復(fù)發(fā)期腦脊液中Th17細(xì)胞增多，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病的早期啟動(dòng)病理具有一定的作用［3］。

Th17細(xì)胞的增殖與分化受多種細(xì)胞因子調(diào)控，包括早期調(diào)控因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-21 和后期的IL-23，這些細(xì)胞因子在MS的病理過(guò)程具有復(fù)雜的聯(lián)系［4］。IL-6和TGF-β促進(jìn)Th17細(xì)胞的病理性分化［5］，IL-21以自分泌形式為主，可替代IL-6而放大Th17細(xì)胞效應(yīng)。關(guān)于TNF-α的作用尚存在爭(zhēng)論。一方面，TNF-α可中和IL-17，下調(diào)T細(xì)胞分泌IFN-γ 的能力，另一方面，體外可促進(jìn) IL-17分泌［6］。IL-23對(duì)Th17的生存和激活支持作用，是介導(dǎo)自身免疫所必需的［7］。早期T細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL-23R，推斷IL-23不參與Th17分化的早期階段［8］。雖然，體外IL-17A與IL-6和IL-23均具有相關(guān)性，但體內(nèi)這些因子的關(guān)聯(lián)性卻罕見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)檢測(cè)MS組患者TNF-α和IL-23均高于炎性脫髓鞘病，且IL-17A和IL-23的在體水平則具有一定的相關(guān)性，與體外研究的結(jié)果是一致的。因此，聯(lián)合三種細(xì)胞因子分析可為脫髓鞘病的鑒別診斷提供參考。

IL-17A與Th17細(xì)胞群具有正相關(guān)。體外刺激MS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)果顯示病程小于2年的MS患者，培養(yǎng)上清中IL-17A和IL-6顯著高于病程大于2年的患者［9］。而IL-23水平與病程長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)。本研究分析MS患者病程與IL-23的相關(guān)性，并未得出陽(yáng)性結(jié)果。分析原因可能是入組樣本量較少，對(duì)評(píng)價(jià)總體水平的差異存在一定的局限性。后續(xù)研究可結(jié)合患者腦脊液中Th17細(xì)胞數(shù)目的定量檢測(cè)，將對(duì)脫髓鞘疾病的實(shí)驗(yàn)診斷更有意義。

1 Segal B M．Th17 cell in autoimmune demyelinating disease［J］．Semin Immunopathol，2010;32(1):71-77．

2 Nordberg M，F(xiàn)orsberg P，Johansson A et al．Cytotoxic mechanisms may play a role in the local immune response in the central nervous system in neuroborreliosis［J］．J Neuroimmun，2011;232(1-2):186-193．

3 Brucklacher-Waldert V，Stuerner K，Kolster M et al．Phenotypical and functional characterization of T helper17 cells in multiple sclerosis［J］．Brain，2009;132(12):3329-3341．

4 Wilson N J，Boniface K，Chan J R et al．Development，cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells［J］．Nat Immunol，2007;8(9):950-957．

5 Ogura H，Murakami M，Okuyama Y et al．Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction［J］．Immunity，2008;29(4):628-636．

6 Kimura A，Kishimoto T．IL-6:Regelator of Treg/Th17 balance［J］．Eur J Immunol，2010;40(7):1830-1835．

7 Bettelli E，Carrier Y，Gao W et al．Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］．Nature，2006;441(7090):235-238．

8 McGeachy M J，Chen Y，Tato C M et al．The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo［J］．Nat Immunol，2009;10(3):314-324．

9 Chen Y，Langrish C L，McKenzie B et al．Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis［J］．J Clin Invest，2006;116(5):1317-1326．