表達α-烯醇化酶重組腺病毒的構(gòu)建及其在籽鵝卵泡顆粒細胞中的過表達

計 紅，王江璐，張偉宏，郭景茹，楊煥民*，柳巨雄，李士澤，孔凡志

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062)

禽類的產(chǎn)蛋性能主要取決于卵巢中卵泡的生長發(fā)育水平，并受品種、環(huán)境和飼養(yǎng)管理等因素的影響。籽鵝是世界上產(chǎn)蛋性能最好的鵝品種之一，研究籽鵝卵泡發(fā)育的調(diào)控機制具有重要的意義。本實驗室利用產(chǎn)蛋前期(5月齡)和產(chǎn)蛋期(8月齡)籽鵝卵巢組織，獲得產(chǎn)蛋期籽鵝卵巢組織高表達的26個差異表達序列標簽(Expressed sequence tags，ESTs)[1]，并對其進行實時熒光定量PCR檢測，表明籽鵝快速生長的卵泡中 α-烯醇化酶(α-Enolase，ENO1)相對表達量顯著高于原始卵泡，通過生物信息學(xué)分析，推測ENO1可能對鵝卵泡發(fā)育具有重要調(diào)控作用[2-3]。

ENO1是一種在細胞質(zhì)和細胞核中表達的糖酵解關(guān)鍵酶，主要催化2-磷酸甘油脫水，生成含高能磷酸鍵的磷酸烯醇式丙酮酸[4]。此外，研究顯示ENO1可以作為纖維蛋白溶酶原受體參與纖溶過程，從而調(diào)節(jié)細胞的融合和分化進程[5]；作為c-myc啟動子結(jié)合蛋白，能夠與c-myc P2啟動子結(jié)合，負向調(diào)控細胞生長、分化[6]；同時還顯示自身免疫病性視網(wǎng)膜病變患者體內(nèi)存在抗ENO1抗體，并特異性定位于神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層，誘導(dǎo)該區(qū)域細胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致失明[7]。

顆粒細胞從卵泡生長啟動、增殖、分化、閉鎖/排卵到卵泡退化，顆粒細胞在數(shù)量、形態(tài)和功能等方面均發(fā)生著各種變化，對促進卵泡發(fā)育具有重要作用。為了研究ENO1對禽類顆粒細胞功能的影響，我們采用在籽鵝卵泡顆粒細胞中過表達ENO1的方法，構(gòu)建籽鵝ENO1重組腺病毒，并在籽鵝卵泡顆粒細胞中進行過表達，為開展ENO1對禽類顆粒細胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及采樣 實驗動物來自黑龍江省大慶市大同區(qū)北方種鵝場，隨機選取5只5月齡品種特征明顯、系譜明確的健康雌性籽鵝，迫殺后迅速采取卵巢組織，用DEPC水洗凈組織樣品，液氮罐中凍存過夜，-80℃冰箱保存。

1.2 菌種、表達載體與主要試劑 DH5a感受態(tài)菌為本實驗室保存；重組穿梭載體pShuttle-CMV-GFP和pAdxsi重組腺病毒骨架載體購自北京諾賽基因組研究中心；限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；T4DNA ligase購自Fermentas公司；pfx DNA ploymerase與TRIzol購自Invitrogen公司；質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒與DNA凝膠回收與純化試劑盒均購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；鼠抗ENO1單克隆抗體(MAb)購自Abcam公司；羊抗鼠Rockland熒光-IgG購自美國Rockland公司；血清(Solarbio)購自北京 Solarbio&Technology公司；培養(yǎng)液(Hyclone M 199)購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。

1.3 總RNA的提取 取籽鵝卵巢組織約30mg，按照TRIzol法進行其總RNA的提取。

1.4 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中登錄的北京鴨ENO1基因序列(M 20749.1)，應(yīng)用Oligo 7.0軟件設(shè)計ENO1編碼區(qū)擴增引物，序列為ENO1α-U：5'-GGTGCGGGGTGTTCAAGATGTC-3'； ENO1α-R：5'-TCCACCAGCAGCCATCAA-3'，預(yù)期擴增片段為1327bp。

1.5 ENO1基因的克隆測序 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以其為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg2+20mmol/L)5μL，dNTP M ixture(2.5mmol/L)8.0μL，模板cDNA 2μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去離子水補充至50.0μL。反應(yīng)條件為：94℃5m in；94℃30s、55℃ 1m in 30s、72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃10m in。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒純化回收。將產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-ENO1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進行序列比對。

1.6 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 將pMD-ENO1及穿梭載體pShuttle-CMV分別用Hin dⅢ和EcoRⅠ雙酶切，切膠回收目的基因片段和載體片段，T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-ENO1。

1.7 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將pShuttle-CMVENO1和pAdxsi重組腺病毒骨架載體質(zhì)粒分別用I-CeuI、I-SceI酶切，回收目的片段和載體片段采用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5a，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV-ENO1。提取重組腺病毒質(zhì)粒，并采用XhoⅠ對其酶切鑒定。

1.8 重組腺病毒的制備及擴大培養(yǎng) 采用質(zhì)粒抽提試劑盒大量抽提pAd-CMV-ENO1，利用PacⅠ酶切使其線性化。通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染80%～90%融合的293(R)細胞，于37℃ 5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至產(chǎn)生細胞病變(CPE)，收集細胞，反復(fù)凍融3次，取細胞培養(yǎng)液上清，在293(R)細胞中傳代，以含20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，逐日觀察CPE。待細胞完全病變后收毒，-80℃保存。

將293(R)細胞按4×106個/瓶的密度接種于6個75cm2培養(yǎng)瓶中，再接種收集的病毒上清，待所有細胞脫落后收獲病變細胞混懸液，于3000g離心5min，棄上清，加入6m LST buffer(培養(yǎng)液+10%血清+2.5%甘油)，混勻后于-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，4000g離心5m in，取上清，按同樣密度接種于40個75cm2方瓶中進行擴增，待細胞完全病變，混懸液于4000g離心，棄上清，沉淀用腺病毒保存液重懸，經(jīng)反復(fù)凍融后于-80℃保存待用。

1.9 重組腺病毒滴度的測定 測定并計算重組腺病毒OD260nm/OD280nm值，反應(yīng)病毒的純度；將重組腺病毒10倍稀釋后，計算病毒的顆粒滴度；采用Reed-Muench法[8]測定重組腺病毒的TCID50值，并計算病毒的感染性滴度。

病毒顆粒滴度(VP/m L)=OD260nm×稀釋倍數(shù)×1.1×1012

1.10 Ad-CMV-ENO1在籽鵝卵泡顆粒細胞中過表達的檢測 培養(yǎng)制備原代籽鵝卵泡顆粒細胞，分為重組腺病毒感染組(Ad-CMV-ENO1)、非重組腺病毒組(Ad-CMV-null)與細胞對照組。將收集的病毒上清接種于顆粒細胞單層培養(yǎng)后，分別提取RNA和蛋白質(zhì)進行基因和蛋白表達量的檢測。

采用實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測各組ENO1基因表達量。檢測引物序列為：ENO1α-U： 5'-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3'；ENO1α-R：5'-GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC-3'，擴增片段183bp。反應(yīng)體系：SYBR Prem ix Ex TaqTM12.5μL，模板 cDNA 2μL，上、下游引物各1μL，去離子水補充至25.0μL。反應(yīng)條件：94℃10m in；94℃ 5s、56℃ 30s、72℃ 20s，45個循環(huán)。

采用western blot檢測蛋白表達量，分別以鼠抗ENO1的 MAb(1∶1000)和 鼠 抗 β-actin 的 MAb(1∶1000)為一抗，以羊抗鼠 Rockland熒光 -IgG(1∶2000)為二抗，熒光顯色，蛋白條帶采用LICOR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行分析，根據(jù)其灰度的深淺和面積大小計算每一條帶的密度值，計算目的蛋白的相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ENO 1基因擴增產(chǎn)物的鑒定 以提取的籽鵝卵巢組織總RNA反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，采用PCR擴增ENO1基因。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1300bp處可見特異性片段，大小與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)過基因測序與核苷酸同源性比對，與北京鴨的同源性可達到97%。

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定 將重組質(zhì)粒pMD-ENO1與穿梭載體pShuttle-CMV酶切后連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-ENO1。將pShuttle-CMV-ENO1和pAdxsi重組腺病毒骨架載體質(zhì)粒酶切后連接，轉(zhuǎn)化 DH5α，構(gòu)建 pAd-CMV-ENO1。提取重組質(zhì)粒，并采用XhoⅠ對其酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，攜帶目的基因表達框的陽性克隆酶切后為7條帶；而腺病毒空質(zhì)粒由6條帶組成。陽性克?。?4.5kb、11.7kb、3.9kb、2.66kb、2.47kb、 1.45kb、 0.6kb； 陰 性 克 隆 ： 14.5kb、11.7kb、4.0kb、2.47kb、1.45kb、0.6kb(圖 2)。

2.3 重組腺病毒的滴度 經(jīng)檢測，OD260nm值為0.483，重組腺病毒的純度為1.29(正常范圍為1.2～1.4)；病毒的顆粒滴度為5.31×1012VP/m L，感染性滴度達 1.1×1011pfu/m L。

2.4 感染率及過表達的鑒定

2.4.1感染率的檢測經(jīng)過條件優(yōu)化，顯示細胞生長48h后，病毒集中于顆粒細胞上清(MOI=350)感染48h后重組腺病毒感染率最高，可達到97%～100%(圖 3)。

2.4.2過表達量的測定

2.4.2.1mRNA表達量的檢測：以持家基因β-actin為內(nèi)參，SYBR GreenⅠ染料法對ENO1基因進行相對定量qRT-PCR檢測。結(jié)果表明，重組腺病毒感染組ENO1mRNA表達量顯著高于另外兩組(p<0.05)，正常細胞對照組與非重組腺病毒感染組ENO1mRNA表達量差異不顯著(圖4)。

2.4 .2.2蛋白表達量的檢測：Western blot分析顯示，重組腺病毒感染組ENO1相對表達量顯著高于另兩組(p<0.05)，正常細胞對照組與非重組腺病毒感染組ENO1相對表達量差異不顯著(圖5、圖6)。

3 討論

通過過表達研究基因?qū)Σ煌?yīng)器(細胞與組織)的影響是目前常用的技術(shù)方法，而基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中構(gòu)建攜帶目的基因的表達載體往往是整個過程的關(guān)鍵[8]。目前，基因轉(zhuǎn)移載體可分為兩大類：非病毒載體和病毒載體。非病毒載體包括脂質(zhì)體、分子偶聯(lián)載體等，其基因轉(zhuǎn)移效率低。常見的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒與慢病毒等。逆(反)轉(zhuǎn)錄病毒能夠隨機整合入宿主DNA，可以引起“插入誘變”，也有可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒；慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，能夠穩(wěn)定整合入宿主細胞持久表達目的基因，感染細胞范圍廣，基因容量較大，缺點是載體的整合是隨機的，靶基因表達受插入位點兩側(cè)的宿主DNA序列影響，并可以導(dǎo)致插入突變。腺病毒為雙鏈DNA病毒，具有感染效率和外源基因表達水平高、高滴度重組病毒的制備較簡單、容量適合裝載大多數(shù)外源基因的優(yōu)點；而缺點是無靶向性、宿主范圍廣、可能造成非靶器官及非靶細胞的感染，治療基因表達持續(xù)時間較短。

本實驗采用的腺病毒載體系統(tǒng)(pAdxsi系統(tǒng))包括穿梭質(zhì)粒載體系統(tǒng)、病毒骨架載體以及包裝細胞系293(R)細胞，其中所采用的腺病毒載體為復(fù)制缺陷型(去掉了E1區(qū)和E3區(qū))，293(R)細胞系是改造過的HEK293細胞。實驗過程中采用直接連接的方案及通過I-CeuI、I-SceI雙酶切位點定向克隆，這兩個酶切位點的優(yōu)點在于可以識別較長的序列，在人類的基因組中幾乎沒有這兩個酶切位點。

腺病毒構(gòu)建過表達載體技術(shù)比較成熟，但目前均以哺乳動物腺病毒作為載體構(gòu)建骨架，無法確定是否感染禽類細胞。經(jīng)過檢測，結(jié)果表明應(yīng)用哺乳動物腺病毒骨架構(gòu)建ENO1重組腺病毒感染禽類細胞，較高的MOI值可以達到95%以上感染率，并且從基因與蛋白水平上同時檢測了ENO1過表達，結(jié)果表明兩個水平表達均有顯著性變化，目前類似試驗較少見。本實驗構(gòu)建了表達ENO1的重組腺病毒，并實現(xiàn)其在籽鵝卵泡顆粒細胞中的過表達，為進一步開發(fā)和研究ENO1的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，同時為動物和人類生殖相關(guān)研究提供了參考。

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