發(fā)光二極管光動力學療法對裸鼠肺移植瘤的抑制作用研究

邵紅霞，杜鐘珍，李 莉，吳 琦

肺癌是當今世界各國最常見的惡性腫瘤之一，80%的肺癌患者在診斷后1年內(nèi)死亡，5年生存率為14%［1］。盡管近年來醫(yī)務工作者在肺癌的預防、早期診斷、早期治療、新化療藥物的發(fā)明及放、化療與手術(shù)相結(jié)合的綜合治療等手段上做了很大的努力，但目前肺癌的總體預后效果仍不理想。肺癌發(fā)病率和病死率居高不下，迫切期望人們突破傳統(tǒng)思維，尋求新的治療方法。光動力學療法 (photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑和光產(chǎn)生的光動力學反應治療腫瘤的一種非手術(shù)治療方法，此方法通過全身或局部應用光敏劑后選擇性地吸收潴留于腫瘤組織內(nèi)，經(jīng)特定波長激光照射，產(chǎn)生光化學作用而殺傷腫瘤細胞。本研究旨在探討發(fā)光二極管 (light－emitting diode，LED)作為PDT光源對裸鼠肺移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株A549購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所。

1.1.2 動物 BALB/C nu/nu裸鼠15只，雄性，4～6周齡，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.1.3 光敏劑與主要試劑 血卟啉衍生物類光敏劑photosan－3，細胞培養(yǎng)基，液態(tài)滅菌F12，Hyclone Inc;胎牛血清，胰蛋白酶，四甲偶氮唑鹽，二甲基亞砜，250 ml細胞培養(yǎng)瓶，100 ml細胞培養(yǎng)瓶，微孔濾膜。

1.1.4 主要設(shè)備 LED激光器;光功率計:PM50，Thorlab，New Jersey;二氧化碳培養(yǎng)箱:D6450，德國Heraeus;倒置顯微鏡:德國Leica;微量加樣器:德國Eppendof;高速臺式離心機:江蘇海門其林貝爾;2010MC型酶標儀;渦旋振蕩器:日本東芝 SCR20BA;－20℃低溫冰箱 (BD－93):海爾;－80℃超低溫冰箱:美國Thermo Forma;防護眼鏡:Thorlab。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 F12培養(yǎng)基，10%小牛血清，含100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素雙抗，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，常規(guī)細胞培養(yǎng)、傳代。細胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)方法參照參考文獻 ［2］介紹的方法進行。

1.2.2 動物移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 r/min離心10 min，取出后棄去上清液，加入培養(yǎng)基2 ml，吸管吹勻，取100 μl計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×105/ml，按每只小鼠0.2 ml注入右腋下皮下，每日開始用游標卡尺測量，粗略估計腫瘤長徑 (a)與短徑 (b)，腫瘤體積 (V)=a×b2×0.5。待腫瘤體積長至50 mm3左右備用。

1.2.3 實驗分組 將15只4～6周齡BALB/C nu/nu雄性裸鼠隨機分為荷瘤對照組、單純激光照射組和LED－PDT治療組，各5只。

1.2.4 光敏劑配置 于實驗前避光條件下在電子天平上稱少許顆粒狀photosan－3，使用PBS液 (pH 7.4)溶液配制成較高濃度工作液，過濾除菌后密封，黑紙包裹4℃避光保存使用，使用時用PBS液梯度稀釋成實驗所需各種不同濃度。每次實驗均臨時配制新鮮的光敏劑溶液。

1.2.5 避光方法 配置與加入光敏劑、照射時均需嚴格避光處理，光敏劑存放、配液均使用專用避光錫箔紙包裹;裸鼠在注射光敏劑藥物后要用黑布遮蓋鼠籠避光，照光時將鼠籠拿入暗室對裸鼠進行PDT，治療后仍要用黑布遮蓋鼠籠。

1.2.6 激光器光源的準備 將光功率計表頭平放在實驗臺上，每次照射前調(diào)整光斑大小超過腫瘤直徑，使用光功率計進行光分布測量。

1.2.7 照射過程 荷瘤對照組不予任何治療;單純激光照射組不予光敏劑，用LED激光器將功率調(diào)至80 mW，照射腫瘤組織局部21 min，使能量密度達到約100 J/cm2;LED－PDT治療組按照20 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射photosan－3，避光5 h后，將LED激光器功率調(diào)至80 mW，在能量密度100 J/cm2條件下進行腫瘤局部PDT。PDT后裸鼠仍避光7 d。

1.2.8 治療后處理 觀察腫瘤組織表面情況，7 d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腫瘤組織，甲醛溶液中固定，固定后進行HE染色，觀察組織壞死情況。測量治療前后裸鼠腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以 ()表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

治療前3組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。治療7 d后，3組腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);其中荷瘤對照組和單純激光照射組腫瘤體積均大于LED－PDT治療組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。治療后，荷瘤對照組、單純激光照射組腫瘤表面無明顯變化，病理顯示腫瘤組織無壞死 (見圖1);LED－PDT組見腫瘤表面壞死、結(jié)痂，鏡下見細胞壞死、崩解、細胞輪廓模糊(見圖2)。

表1 3組治療前后腫瘤體積比較(，mm3)Table 1 Comparison of tumor volume among 3 groups before and after treatment

表1 3組治療前后腫瘤體積比較(，mm3)Table 1 Comparison of tumor volume among 3 groups before and after treatment

5 497.79±50.55 561.61±49.45單純激光照射組 5 515.24±45.14 573.92±33.26 LED－PDT治療組組別 只數(shù) 治療前 治療后荷瘤對照組5 550.54±63.55 554.13±71.24

圖1 正常腫瘤組織，無細胞結(jié)構(gòu)破壞，凋亡 (HE染色，×10)Figure 1 Normal tumor tissue，without cell structural damage，apoptosis

圖2 壞死腫瘤組織，細胞已溶解破壞，不能見到完整腫瘤細胞 (HE染色，×40)Figure 2 Necrotic tumor tissue，cells lysised，without intact tumor cells

3 討論

肺癌是當今世界對人類健康及生命危害最大的惡性腫瘤之一，目前手術(shù)、放化療仍是治療肺癌的首選方法。但是對于一部分心、肺功能較差或伴有其他系統(tǒng)疾病，不宜手術(shù)的早期肺癌患者，這些方法創(chuàng)傷或毒副作用較大，常難以接受;而對于晚期出現(xiàn)呼吸道堵塞癥狀的患者，上述方法不能多次應用且無法有效控制堵塞癥狀，嚴重影響晚期肺癌患者的生活質(zhì)量［3－4］。PDT是隨著光纖技術(shù)、激光醫(yī)學和內(nèi)鏡技術(shù)發(fā)展而興起的一種治療惡性腫瘤的新方法［5］，已在實體腫瘤的臨床治療中被廣泛應用。PDT通過光敏劑在惡性腫瘤組織與正常組織形成一定的濃度差時，給予腫瘤組織照射特定波長的光，光敏劑吸收光子的能量后，產(chǎn)生一系列氧化活性分子。這些氧化活性分子通過氧化作用攻擊腫瘤細胞使其死亡，達到治療目的。

目前認為，PDT除了直接細胞殺傷機制，還可以通過以下兩種機制抗腫瘤生長［6］:(1)脈管損傷機制:使腫瘤血管阻塞;(2)免疫應答機制:使腫瘤組織內(nèi)淋巴細胞、白細胞、巨核細胞大量聚集。PDT已較多應用于皮膚等淺表腫瘤，主要是因其便于照射治療的特點，近幾年發(fā)現(xiàn)PDT應用于上消化道腫瘤亦可以達到治療效果［7－8］。并已有報道稱光動力對上消化道腫瘤可以達到治愈效果［9］，這為腔內(nèi)腫瘤的早期無痛苦治愈及晚期姑息治療提供了新的方法。

本實驗采用荷瘤裸鼠活體實驗來觀察LED－PDT治療肺癌的療效，光敏劑照射組可見腫瘤組織表面變紅，治療后連續(xù)觀察可見腫瘤表面出現(xiàn)壞死，觀察7 d發(fā)現(xiàn)腫瘤生長速度與其他兩組相比明顯減慢，1周后腫瘤部位出現(xiàn)干燥、結(jié)痂、組織壞死。處死小鼠后，鏡下見細胞壞死、崩解、細胞輪廓模糊，而荷瘤對照組及單純照射組均無此變化。本實驗通過荷瘤裸鼠活體實驗說明，PDT對肺癌細胞有直接殺傷作用，為光動力學在肺癌的臨床治療中的應用奠定了實驗基礎(chǔ)。

PDT與目前常用的外科手術(shù)、化療和放療相比，最大的優(yōu)點在于可選擇性殺傷腫瘤細胞，對正常細胞損害小，并可與其他療法聯(lián)合使用，具有良好的臨床應用前景。在PDT治療過程中，激光光源良好的可控性更加強了PDT的選擇性，對腫瘤組織殺傷效應強，對正常組織損傷小，同時穿透深度有限。本實驗所用激光器以紅光LED作為激光光源，因為其具有體積小、使用方便、使用壽命長、功率輸出穩(wěn)定等優(yōu)點。雖然作為照明設(shè)備，LED成本高于白熾燈，但是作為PDT光源，與其他激光器相比，LED材料具有較易獲得、堅固耐用、壽命長的特點，可以大大降低治療成本［2］。LED光源最大優(yōu)勢在于輸出功率小，功率穩(wěn)定，為得到與大激光器相同的能量密度，LED需要更長照射時間，而此過程LED可以保證較穩(wěn)定的功率輸出。另外LED相對大激光器價格便宜，更適于推廣應用［10］?？梢?，LED作為PDT光源具有更大的優(yōu)勢，更具發(fā)展前景。

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