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    脊髓性肌萎縮癥SMN1 和SMN2 基因拷貝數(shù)變異分析

    2013-09-10 01:40:46周水珍劉仁超
    中國循證兒科雜志 2013年3期
    關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)雜合外顯子

    王 佶 安 宇 周水珍 王 藝 劉仁超

    脊髓性肌萎縮癥( SMA) 是常染色體隱性遺傳性神經(jīng)肌肉病,人群中發(fā)病率為1/6 000 ~1/10 000 活產(chǎn)嬰兒,最近報(bào)道中國人群SMA 致病基因的攜帶者頻率為1/42[1]。SMA 居致死性常染色體隱性遺傳病第2 位,僅次于囊性纖維變性[2~4]。位于染色體5q11.2 ~q13.3 上的運(yùn)動神經(jīng)元存活( SMN) 基因是SMA 的主要致病基因,具有兩個(gè)高度同源的拷貝SMN1 和SMN2,兩者僅有5 個(gè)堿基的差別,分別位于第7、8 外顯子和第6、7 內(nèi)含子中。既往研究已證實(shí)SMN1 基因突變可導(dǎo)致SMA 發(fā)病,SMN2 基因是臨床表型的調(diào)節(jié)基因,拷貝數(shù)增加可減輕SMA 的表型[2,5]。近年來中國對SMN2 基因的研究較少[6,7],缺乏表型與基因型的分析研究,同時(shí)SMA 基因診斷國內(nèi)多采用PCR-RFLP 分析技術(shù),可判斷SMN 基因純合缺失,但不能分析雜合缺失。本研究納入臨床診斷的SMA 患兒,以多重連接探針擴(kuò)增( MLPA) 技術(shù)行SMN1 基因缺失和SMN2 基因拷貝數(shù)檢測,分析其與臨床表型關(guān)系,以豐富中國人群SMA 研究數(shù)據(jù)。

    1 方法

    1.1 SMA 診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型 神經(jīng)??漆t(yī)生根據(jù)發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展程度進(jìn)行臨床診斷[8],檢測到SMN1 基因缺失可確診。根據(jù)1992 年國際SMA 協(xié)作組制定的兒童型SMA 的臨床分類標(biāo)準(zhǔn),分為3 個(gè)亞型[8]:Ⅰ型:6 月齡內(nèi)發(fā)病,全身肌肉無力,肌張力減退,不能坐和站立,通常在2 歲內(nèi)死于呼吸衰竭; Ⅱ型:6 月齡后發(fā)病,能坐但不能獨(dú)自行走,多數(shù)在進(jìn)入青春期前死于呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥;Ⅲ型:18 月齡后發(fā)病,能坐和行走,預(yù)期壽命不減少,起病初可表現(xiàn)為走路不穩(wěn)和易跌倒等癥狀。

    1.2 研究對象 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院( 我院) 臨床診斷為SMA 的患兒,納入SMN1 基因第7 和8 外顯子檢測到突變的確診病例,同時(shí)檢測患兒父母的SMN1 基因,分析雜合突變情況。本研究SMA 相關(guān)致病基因的檢測均獲得患兒家屬的口頭知情同意。

    1.3 MLPA 拷貝數(shù)分析 采集患兒外周靜脈抗凝血3 mL,采用QIAgen 公司試劑盒( QIAamp DNA blood MiNi Kit 1250,Cat No.51106) 抽取DNA 溶液2 ~5 μg,-20℃保存。

    參照SMA MLPA 檢測試劑盒( SALSA MLPA P060-B2 SMA probemix,MRC,荷蘭) 的操作說明進(jìn)行DNA 變性、探針雜交、連接和熒光引物PCR 擴(kuò)增,應(yīng)用ABI 公司的3130自動化序列分析儀進(jìn)行擴(kuò)增片段分離、峰高和峰面積的檢測。檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用GENEMAKER 1.95 軟件分析處理。根據(jù)試劑盒的說明推算SMN1 和SMN2 基因第7 和8 外顯子的拷貝數(shù): SMN1 或SMN2 的信號與內(nèi)參信號的比值為0.7 ~1.3,拷貝數(shù)為2,表示為正常;比值為0.35 ~0.65,拷貝數(shù)為1,為雜合缺失; 比值為0 表示沒有拷貝,為純合缺失;比值為1.3 ~1.5,拷貝數(shù)為3;比值為1.5 ~2,拷貝數(shù)為4。以拷貝數(shù)2 為參照,多于2 個(gè)拷貝數(shù)即為重復(fù)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以表示,計(jì)數(shù)資料以百分比表示,率的顯著性采用χ2檢驗(yàn),P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 SMN1 基因拷貝數(shù)與臨床表型關(guān)系 41 例臨床診斷SMA 患兒進(jìn)行了基因檢測,37/41 例( 90.2%) SMN1 基因第7 和( 或) 第8 外顯子純合缺失進(jìn)入分析,其中36 例(97.3%) 為第7 和8 外顯子均純合缺失( 圖1A) ,1 例僅第7 外顯子純合缺失。男20 例,女17 例。平均發(fā)病年齡(7.5 ±7.0) 個(gè)月,3 d 至6 月齡19 例,~18 月齡14 例,~3歲2 例,>3 歲2 例。Ⅰ型20 例( 54.1%) ,Ⅱ型15 例(40.5%) ,Ⅲ型2 例( 5.4%) ,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型平均發(fā)病年齡分別為(2.9 ±1.8) 、(10.7 ±1.9) 和(30.0 ±8.5) 個(gè)月。

    2.2 SMN2 基因拷貝數(shù)與臨床表型關(guān)系 37 例SMN1 基因第7 和( 或)8 外顯子純合缺失患兒中,SMN2 基因第7 和8 外顯子拷貝數(shù)2 為18 例(48.6%) ,平均發(fā)病年齡(4.9 ±3.9) 個(gè)月,Ⅰ型13 例( 72.2%) ,Ⅱ型5 例( 27.8%) ; 第7和8 外顯子重復(fù)( 拷貝數(shù)3 或4) 為17 例( 45.9%) ( 圖1B) ,第7 外顯子重復(fù)為2 例( 5.4%) ,平均發(fā)病年齡( 9.9 ± 8.5) 個(gè) 月,Ⅰ型7 例( 36.8%) ,Ⅱ型10 例(52.6%) ,Ⅲ型2 例( 10.5%) ,Ⅱ和Ⅲ型的比例顯著高于拷貝數(shù)2 的病例( P <0.05) 。

    圖1 SMA 患兒SMN1 和SMN2 基因MLPA 檢測結(jié)果Fig 1 The results of SMN1 and SMN2 gene detection with MLPA method in SMA children

    2.3 SMN1 基因雜合缺失與表型 5 例患兒父母行SMN1基因檢測,檢出雜合缺失9 例,其中4 例患兒父母均為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失( 圖1C) ;1 例患兒父親為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失,母親未檢測到純合或雜合缺失。5 例患兒父母均未見肌肉無力及萎縮等臨床表現(xiàn)。另有1 例檢出SMN1 基因第7 和第8 號外顯子雜合缺失,其臨床特征、肌電圖及肌肉活檢均符合SMAⅠ型的診斷,尚待SMN1 基因測序明確是否存在SMN 基因點(diǎn)突變。

    3 討論

    SMA 的輔助檢查主要有肌電圖、肌酶和肌肉活檢。肌電圖是定位診斷,但特異度不高。肌酶在鑒別其他肌無力疾病中有參考意義,但對SMA 診斷無特異性。肌肉活檢由于取材的創(chuàng)傷性,患兒不易接受,因此SMA 的基因檢測受到臨床的青睞。既往采用的PCR-RFLP 法由Lefebvre 等[9]建立,除不能分析雜合突變外,實(shí)驗(yàn)要求高、操作繁瑣和穩(wěn)定性差等限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。國內(nèi)也有采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測SMN 基因拷貝數(shù)的報(bào)道,該方法檢測靈敏,但因優(yōu)化為穩(wěn)定和高效的實(shí)驗(yàn)體系較困難,且不同實(shí)驗(yàn)室采用不同的內(nèi)參照無法互相比較,對于重復(fù)大于3 以上的拷貝數(shù)難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù),其用于臨床檢測的實(shí)用性不如MLPA。MLPA 是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)[10],可對待測基因所有外顯子進(jìn)行缺失、重復(fù)及某些點(diǎn)突變檢測[11],國外已有采用該技術(shù)分析SMN 基因純合缺失、雜合缺失和拷貝數(shù)的報(bào)道[12,13]。我院自2011 年10 月起在臨床應(yīng)用MLPA 技術(shù)用于SMA的診斷。

    研究表明80% ~90%的SMA 為SMN1 基因純合缺失,5% ~10%的SMA 是由于SMN1 基因發(fā)生復(fù)合雜合突變所致,即一個(gè)SMN1 等位基因缺失,另一個(gè)SMN1 等位基因發(fā)生點(diǎn)突變[14,15]。歐美人群中SMN1 基因純合缺失檢測已成為診斷和排除診斷SMA 的首選方法[16]。本文41 例臨床診斷SMA 患兒SMN1 基因第7 和( 或) 8 外顯子純合缺失檢出率為90.2%,提示可作為SMA 患兒的首選確診方法,特別是松軟嬰兒( floppy infant) 在嬰兒期臨床表現(xiàn)難以做出臨床診斷時(shí),且肌電圖不能做出定性診斷時(shí),肌肉活檢對于小嬰兒也存有一定困難時(shí),基因檢測的價(jià)值更大。本文9/10 名患兒父母檢出雜合缺失,但均無臨床表現(xiàn),為攜帶者;提示檢測雜合突變一方面可以防止漏診,另一方面也可為產(chǎn)前診斷和咨詢提供依據(jù)。

    SMN2 基因產(chǎn)生10%全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,是臨床表型的調(diào)節(jié)基因,基因拷貝數(shù)越多,產(chǎn)生全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也增多[5],可部分補(bǔ)償SMN 蛋白的不足,減輕SMA 表型嚴(yán)重程度[17],也可預(yù)測SMA 急性或慢性病程[18]。Feldkǒtter 等[2]對375例SMA 病例的研究也顯示,SMN2 基因拷貝數(shù)與SMA 表型嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。本文采用MLPA 技術(shù)對SMN2 基因拷貝數(shù)變異檢測,顯示拷貝數(shù)為2 個(gè)的18 例患兒平均發(fā)病年齡較早[(4.9 ±3.9) 個(gè)月],其表型以Ⅰ型為主( 13 例) ;SMN2 基因拷貝數(shù)3 或4 患兒的平均發(fā)病年齡稍晚[(9.9 ±8.5) 個(gè)月],表型以Ⅱ型為主( 10/17 例) ,提示基因拷貝數(shù)檢測可作為臨床判斷SMA 預(yù)后的方法之一。

    本文的局限性:SMA Ⅲ型患兒例數(shù)較少,且未進(jìn)一步細(xì)化分析臨床表型和基因拷貝數(shù)的相關(guān)性,待今后研究進(jìn)一步完善。

    致謝:感謝參加本研究的患兒及家屬;感謝復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院神經(jīng)科醫(yī)生和兒科研究所技術(shù)人員的支持。

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