大孔吸附樹脂純化玉竹總黃酮工藝研究

鐘方麗 王曉林 王志敏 陳 帥

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

玉竹又名葳蕤、萎蕤、女萎，是黃精屬植物玉竹（Rhizoma Polygonati Odorati.）的地下根莖，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草正義》中均有記載，該藥在中國(guó)已有幾千年的用藥歷史，性平，味甘，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴的功能，用于熱病口燥咽干、干咳少痰、心煩心悸、糖尿病等疾病的治療［1，2］。藥理學(xué)研究［3］表明，玉竹還有強(qiáng)心、擴(kuò)張血管、降血壓、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能等作用。經(jīng)研究［4］發(fā)現(xiàn)，玉竹中含量較高的是多糖類化合物，一般含量為6.51%～10.27%，此外，還有甾體皂苷、黃酮、生物堿、甾醇、強(qiáng)心苷等活性成分，具有較高的食用與藥用開發(fā)價(jià)值。玉竹中所含的黃酮及黃酮苷又稱黃堿素類化合物，是存在于植物界的一類天然色素，為許多中草藥的有效成分［5］，玉竹總黃酮能清除二苯基苦味肼基自由基（DPPH），能增強(qiáng)衰老模型小鼠血液中SOD活性，降低肝組織中 MDA含量［6］。

大孔吸附樹脂分離技術(shù)是利用大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能從中藥提取液中分離精制有效成分或有效部位的技術(shù)。D－101型大孔吸附樹脂是一種非極性樹脂，已廣泛應(yīng)用于天然植物（如桑葉、山楂、槐角、滁菊花）的黃酮類化合物的分離純化［7］，但未見有關(guān)玉竹總黃酮純化工藝研究的報(bào)道。本試驗(yàn)擬使用6種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂分別對(duì)玉竹總黃酮進(jìn)行純化，并優(yōu)化D－101型大孔吸附樹脂純化玉竹總黃酮的工藝條件，旨在為生產(chǎn)中更有效利用玉竹、發(fā)揮其最大經(jīng)濟(jì)效益提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉竹：中藥飲片，安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司；

蘆丁對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；

大孔吸附樹脂：LSA－21、LSA－10、AB－8、LX－36、D－101、LSA－33型，西安藍(lán)曉科技有限公司；

硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外－可見分光光度計(jì)：752N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水真空泵：SHZ－D型，河南省鞏義市英峪儀器一廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：CS101－AB型，中國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

電子天平：JY2002型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量測(cè)定方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品（于105℃干燥至恒重）10.0mg，置于50mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液，超聲使之溶解，并用50%乙醇溶液定容至刻度，制得蘆丁對(duì)照品溶液（0.20mg／mL）。精密吸取上述蘆丁對(duì)照品溶液0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0mL分別 置于50mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置6min，加入4%NaOH溶液4.0mL，加入50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min。以50%乙醇溶液為空白對(duì)照，按照紫外分光光度法于512nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］，回歸方程為A ＝0.010 72C＋0.009 79，R ＝0.999 8，結(jié)果表明蘆丁在0.0～48.0μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

（2）樣品含量測(cè)定：吸取相應(yīng)的玉竹總黃酮樣品液、樹脂吸附后的溶液和解吸液各適量，分別置于容量瓶中，按1.2.1（1）的方法，于512nm處測(cè)定吸光度，以不加供試品的平行樣為空白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

1.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取6種樹脂LSA－21、LSA－10、AB－8、LX－36、D－101、LSA－33各10g加入柱中，先以95%乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次約2h，至流出液加水（1∶5）不渾濁為止，后用蒸餾水洗至無醇味；然后用5%HCl浸泡4h后以4～6BV／h洗滌2h后用蒸餾水洗至中性；最后用2%NaOH溶液浸泡6h后以4～6BV／h洗滌2h后用蒸餾水洗至中性，處理完畢后置于密閉容器中備用［9］。

1.2.3 玉竹總黃酮樣品液的制備 稱取干燥的玉竹120g于圓底燒瓶中，加入960mL 80%的乙醇熱回流3次，每次2h，過濾，合并以上3次的濾液，濃縮，80%乙醇定容于容量瓶中作為玉竹總黃酮樣品液，待用。

1.2.4 大孔吸附樹脂的選擇 各取2g 6種處理后的樹脂至100mL具塞三角瓶中，再加入0.635 9mg／mL的玉竹總黃酮樣品液40mL［10］，間隔10min振搖1次，每次約30s，共2h，靜止48h，分別精密吸取6種樹脂吸附后的溶液1.0mL，按1.2.1（1）的方法，于512nm處測(cè)定吸光度A，將靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，然后將上述樹脂加入到具塞三角瓶中，于室溫條件下加入100mL 95%乙醇進(jìn)行解吸，間隔10min振搖1次，每次約30s，共2h，靜置48h，分別精密吸取各解吸液5.0mL，按1.2.1（1）的方法，于512nm 處測(cè)定吸光度A，從而計(jì)算各種樹脂對(duì)玉竹總黃酮的吸附率和解吸率。計(jì)算公式見式（1）～ （3）［11］：

式中：

R1—— 吸附率，%；

R2—— 解吸率，%；

R3—— 純度，%；

C0——起始玉竹總黃酮樣品液中總黃酮的濃度，mg／mL；

C1——吸附48h后玉竹總黃酮樣品液中總黃酮的濃度，mg／mL；

C2——解吸液中玉竹總黃酮的濃度，mg／mL；

V1—— 玉竹總黃酮樣品液的體積，mL；

V2—— 解吸液的體積，mL；

m1——解吸液干燥后干浸膏的質(zhì)量，mg；

m2—— 解吸液中總黃酮的質(zhì)量，mg。

1.2.5 靜態(tài)吸附和解吸的單因素試驗(yàn)

（1）吸附時(shí)間的確定：稱取D－101型大孔樹脂2g，共稱取7份，置于6個(gè)干燥的100mL三角瓶中，各加入20mL 0.356 5mg／mL的玉竹總黃酮樣品液，分別振蕩吸附1，2，3，4，5，6，7h，每10min振搖1次，每次振搖30s，過濾，各取吸附后液4.0mL于7個(gè)10mL容量瓶中，測(cè)定溶液中總黃酮的含量，計(jì)算吸附率。

（2）解吸液乙醇濃度的確定：稱取D－101型大孔樹脂2g，共稱取5份，置于5個(gè)干燥的100mL三角瓶中，各加入20mL供試品溶液，振蕩吸附3h，每10min振搖1次，每次振搖30s。吸附結(jié)束后用蒸餾水洗滌并用吸水紙吸干殘留于樹脂上的液體，然后向裝有樹脂的三角瓶中分別加50mL 10%，30%，50%，70%，90%的乙醇，振搖解吸，過濾，過濾后的解吸液各取4.0mL于5個(gè)10mL容量瓶中，測(cè)定溶液中總黃酮的含量，計(jì)算解吸率。

（3）解吸液乙醇用量的確定：稱取D－101型大孔樹脂2g，共稱取7份，置于7個(gè)干燥的100mL三角瓶中，各加入20mL供試品溶液，振蕩吸附3h，每10min振搖1次，每次振搖30s。然后向裝有樹脂的三角瓶中分別加入20，30，40，50，60，70，80mL的90%乙醇，振搖解吸，過濾，過濾后的解吸液分別移取4.0mL于7個(gè)25mL容量瓶中，測(cè)定溶液中總黃酮的含量，計(jì)算解吸率。

（4）解吸時(shí)間的確定：稱取D－101型大孔樹脂2g，共稱取7份，置于7個(gè)干燥的100mL三角瓶中，各加入20mL供試品溶液，振蕩吸附3h，每10min振搖1次，每次振搖30s。吸附結(jié)束后用蒸餾水洗滌并用吸水紙吸干殘留于樹脂上的液體，然后向裝有樹脂的三角瓶中分別加入70mL 90%的乙醇，分別振搖解吸1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0h，過濾后的解吸液各移取4.0mL于7個(gè)10mL容量瓶中，測(cè)定溶液中總黃酮的含量，計(jì)算解吸率。

（5）吸附液pH的確定：稱取D－101型大孔樹脂2g，共6份，置于6個(gè)干燥的100mL三角瓶中，各加入20mL 0.356 5mg／mL的玉竹總黃酮樣品液，分別用5%HCl和5%NaOH調(diào)pH 為4，5，6，7，8，9，然后振蕩吸附3h，每10min振搖1次，每次振搖30s，過濾，過濾后的吸附后液，各取4mL于6個(gè)10mL容量瓶中，測(cè)定溶液中總黃酮的含量，計(jì)算不同吸附pH的吸附率。

1.2.6 靜態(tài)吸附和解吸的正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以解吸率為考察指標(biāo)，選擇主要考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)以進(jìn)一步優(yōu)化工藝。在所有試驗(yàn)中，每次試驗(yàn)取用的大孔樹脂為2g。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的選擇結(jié)果

在相同的試驗(yàn)條件下，6種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂經(jīng)過靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)，分別得到各種樹脂對(duì)玉竹總黃酮的靜態(tài)吸附率及解吸率，結(jié)果見表1。

由表1可知，LSA－33型樹脂的吸附率最高，LX－36型樹脂的吸附率最低，但6種樹脂的吸附率差別較??；從解吸率角度看，D－101型樹脂的解吸率最高，達(dá)到了40.50%，而LSA－33和LSA－10型樹脂的解吸率只有20%左右，試驗(yàn)結(jié)果表明D－101型大孔樹脂對(duì)玉竹總黃酮的解吸率最高。故選用D－101型大孔樹脂作為進(jìn)一步試驗(yàn)所用的樹脂型號(hào)。

2.2 靜態(tài)吸附和解吸工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了吸附液pH值、吸附時(shí)間、解吸液濃度、解吸液用量／樹脂質(zhì)量（V／m）及解吸時(shí)間的水平值，各因素的水平表設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，D－101型大孔樹脂純化玉竹總黃酮的最佳試驗(yàn)條件為A2B4C2D1E3，即最佳純化工藝為吸附時(shí)間5h，解吸時(shí)間3.5h，解吸液用量／樹脂質(zhì)量25（V／m），解吸液乙醇濃度60%，最佳樣品液pH值8，在該條件下，大孔樹脂純化玉竹總黃酮的靜態(tài)解吸率最大。

表1 6種大孔樹脂對(duì)玉竹總黃酮的吸附率與解吸率的測(cè)定結(jié)果Table 1 Experimental result of adsorption and desorption rate of total flavonods with six types macroporous resins

表2 因素水平表Table 2 Table of factors and levers

2.3 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了考察上述優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)行了3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，3次實(shí)驗(yàn)的吸附率和解吸率分別為 81.15%，80.25%，81.58% 和 48.29%，49.78%，48.17%，平均吸附率和解吸率分別為80.99%和48.75%，具有較好的重現(xiàn)性。

2.4 玉竹干浸膏的制備及浸膏中總黃酮含量的測(cè)定

稱取D－101型大孔樹脂6g，共3份，置于3個(gè)干燥的250mL三角瓶中，分別加入60mL玉竹樣品液（總黃酮濃度為0.368 7mg／mL，其浸膏中總黃酮含量為 4.075mg／g），振蕩吸附5h，每10min振搖1次，每次振搖30s，然后向帶有樹脂的3個(gè)三角瓶中各加入60%的乙醇溶液150mL，振蕩解吸3.5h，過濾，各取4.0mL過濾后的解吸液于3個(gè)具塞試管中，按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮的含量。再取50mL總黃酮濃度為0.368 7mg／mL的玉竹樣品液和100mL解吸液置于稱重后的蒸發(fā)皿中水浴濃縮至干，然后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中（60℃）干燥至恒重，稱重，計(jì)算干浸膏及其總黃酮的含量。結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of orthogonal test

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of purification process validation of total flavonods in Rhizoma Polygonati Odorati.with D－101 macroporous resins

由表4可知，經(jīng)D－101型大孔吸附樹脂處理玉竹提取液后，干膏中總黃酮含量由大約4mg／g提高到21mg／g左右。

3 結(jié)論

采用D－101型大孔樹脂可以對(duì)玉竹總黃酮進(jìn)行初步純化，但由于玉竹所含化學(xué)成分復(fù)雜，除了少量的黃酮類化合物外，還含有大量的植物多糖及甾體皂苷、生物堿、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強(qiáng)心苷等多類成分，所以純化后玉竹干浸膏中的總黃酮純度較低，這主要是由于玉竹中黃酮類化合物含量太低所造成的。若要使玉竹提取物中總黃酮的純度進(jìn)一步提高，則需要采用必要的方法提高玉竹總黃酮樣品液的含量，然后再采用D－101型大孔吸附樹脂對(duì)其進(jìn)行分離純化，上述試驗(yàn)結(jié)果為玉竹提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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