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    分段調(diào)控優(yōu)化阿維拉霉素生產(chǎn)菌罐上發(fā)酵參數(shù)

    2013-09-07 10:36:32潛媛媛
    食品與機(jī)械 2013年1期
    關(guān)鍵詞:變溫效價(jià)菌體

    潛媛媛 陳 敏 王 宏

    (1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310012;2.浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司,浙江 蘭溪 321100)

    阿維拉霉素又名卑霉素、阿美拉霉素、肥拉霉素[1],既是一種抗生素又是一種新型的消化促進(jìn)劑和代謝調(diào)節(jié)劑[2],主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,對(duì)革蘭氏陰性菌效果較差[3]。阿維拉霉素作為飼料添加劑,具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特、安全性高、毒性小、低殘留等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用在禽畜飼料中。目前阿維拉霉素僅由美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn),并且受專利保護(hù)。國(guó)內(nèi)外對(duì)阿維拉霉素罐上發(fā)酵的研究較少,多數(shù)通過(guò)優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝以提高阿維拉霉素產(chǎn)量[4-6],且鮮少有對(duì)阿維拉霉素的罐上發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分段調(diào)控的研究。

    阿維拉霉素是綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces viridoehrongenes)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,一般在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期后期或穩(wěn)定期合成。本試驗(yàn)擬以阿維拉霉素生產(chǎn)菌Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株為研究對(duì)象,通過(guò)分段調(diào)控并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)其罐上發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,旨在提高該菌株罐上發(fā)酵合成阿維拉霉素的產(chǎn)量。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    綠色產(chǎn)色鏈霉菌 (Streptomyces viridoehrongenes)N-0104:浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司;

    藤黃微球菌 (Microccus luteus)10209:中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

    1.1.2 主要儀器與設(shè)備

    全溫振蕩培養(yǎng)箱:HZ-F160型,太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;

    發(fā)酵罐:BIOTECH-2002型,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;

    立式壓力蒸汽滅菌鍋:YXQ-LS-75Ⅱ型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;

    可見(jiàn)分光光度計(jì):JH721型,上海菁華科技儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱:SHP-250型,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀:ZY-300IV型,北京先驅(qū)威鋒科技開(kāi)發(fā)公司;

    pH計(jì):DELTA 320型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

    活化 培 養(yǎng) 基 (g/L):可 溶 性 淀 粉 20.0,KNO31.0,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,瓊脂20.0,pH 7.2~7.4。

    種子培養(yǎng)基(%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)):黃豆餅粉1.5,酵母粉0.25,葡萄糖0.5,糊精2.0,氯化鈣1.8,碳酸鈣0.1,pH 6.4~6.7。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)):葡萄糖1.8,黃豆餅粉1.3,精制豆油1.0,氯化鈣1.8,碳酸鈣0.5,氯化鈉0.1,硝酸鈉0.45,氯化錳0.005,七水硫酸亞鐵0.005,硫酸鎂0.005,硫酸鋅0.005,硫酸銅0.001,硫酸鈷0.001,硫酸銨0.2,玉米淀粉4.0,消泡劑0.03,pH 6.6~6.9。

    檢定培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,瓊脂20.0,pH 7.0~7.2。

    阿維拉霉素預(yù)混劑:10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),美國(guó)禮來(lái)公司。

    1.2 培養(yǎng)方法

    1.2.1 種子培養(yǎng) 用接種鏟取1cm×1cm的單菌落菌種塊,接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的1 000mL錐形瓶中,28℃、200r/min條件下培養(yǎng)48h。

    1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

    (1)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量取種子培養(yǎng)液,在無(wú)菌條件下接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中,28℃、200r/min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間,并在培養(yǎng)了24h時(shí)補(bǔ)加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的L-纈氨酸。

    (2)罐上發(fā)酵培養(yǎng):按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量在裝有7L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中接入種子培養(yǎng)液,在28℃,通氣量1∶1,溶氧30%,罐壓0.03~0.05MPa下培養(yǎng)一定時(shí)間,并在培養(yǎng)了24h時(shí)補(bǔ)加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))L-纈氨酸。

    1.3 測(cè)定方法

    1.3.1 pH的測(cè)定 取10mL培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液,搖勻后在pH計(jì)上直接讀數(shù)。

    1.3.2 菌體濃度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[7]測(cè)定。

    1.3.3 還原糖和總糖的測(cè)定 采用 DNS法[8]。

    1.3.4 氨態(tài)氮的測(cè)定 采用甲醛滴定法[9]。

    1.3.5 阿維拉霉素含量的測(cè)定 采用微生物檢定法[10]。

    1.4 罐上發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

    1.4.1 變溫發(fā)酵條件優(yōu)化 根據(jù)Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株搖瓶生長(zhǎng)曲線確定菌種的搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)期和阿維拉霉素合成期,設(shè)計(jì)菌株生長(zhǎng)期溫度和阿維拉霉素合成期溫度的2因素3水平正交試驗(yàn),通過(guò)搖瓶變溫發(fā)酵確定最優(yōu)組合。然后進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株罐上變溫發(fā)酵驗(yàn)證,并對(duì)菌株罐上變溫發(fā)酵與恒溫發(fā)酵的阿維拉霉素產(chǎn)量進(jìn)行比較。

    1.4.2 罐上發(fā)酵pH調(diào)控 阿維拉霉素生產(chǎn)菌的菌體生長(zhǎng)較適pH為7.0~7.2,所以培養(yǎng)基滅菌后pH調(diào)在7.1左右[7]。而由于堿性條件下有利于阿維拉霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)素,所以在菌體后期阿維拉霉素合成期分別控制pH在7.5,8.0,8.5,進(jìn)行比較選擇 Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株后期阿維拉霉素合成的最適pH。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 變溫發(fā)酵條件優(yōu)化

    2.1.1 搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線 按1.2.2中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株的搖瓶發(fā)酵。考察菌株搖瓶發(fā)酵過(guò)程各代謝參數(shù)的變化,結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

    圖1 搖瓶培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基pH及還原糖變化曲線Figure 1 Time course of pH and reducing sugar of medium in 250mL-triangle flasks

    圖2 搖瓶培養(yǎng)條件下菌體濃度及效價(jià)變化曲線Figure 2 Time course of cell volume and titer in 250mL-triangle flasks

    由圖2菌體濃度-時(shí)間曲線可知,搖瓶發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)速度快,菌體濃度快速增加。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,菌體濃度增加的速度變慢。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入后期時(shí),由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不足造成菌體自溶,菌體濃度下降。由效價(jià)-時(shí)間曲線可知,0~4d主要為菌體的生長(zhǎng)期,阿維拉霉素合成很少。4d之后阿維拉霉素效價(jià)上升速度加快,阿維拉霉素不斷積累。9d之后阿維拉霉素產(chǎn)量變化很小,其中10d時(shí)達(dá)到最大 值 700.14mg/L。 可 以 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株的搖瓶發(fā)酵周期為10d,其中0~4d為菌體生長(zhǎng)期,5~10d為菌體阿維拉霉素合成期。

    2.1.2 搖瓶變溫發(fā)酵試驗(yàn) 由文獻(xiàn)[7]和[11]可知,阿維拉霉素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)溫度一般為28℃,故以28℃為中心點(diǎn),設(shè)計(jì)Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株搖瓶變溫發(fā)酵的2因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1,正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2及表3。

    由表2可知,因素A對(duì)于菌體濃度來(lái)說(shuō)是主要因素,對(duì)于效價(jià)來(lái)說(shuō)是次要因素,但是對(duì)于兩個(gè)指標(biāo)來(lái)說(shuō)都是以A2為最佳水平,選取A2。因素B對(duì)于效價(jià)來(lái)說(shuō)是主要因素,對(duì)于菌體濃度來(lái)說(shuō)是次要因素,根據(jù)在確定某個(gè)因素的水平時(shí)首先應(yīng)選擇該因素作為主要因素的優(yōu)水平的原則[12],選取B1。由表3可知,因素A與B對(duì)菌體濃度有影響,因素A與B對(duì)效價(jià)有高度顯著的影響。最終變溫發(fā)酵的條件為生長(zhǎng)期溫度28℃,阿維拉霉素合成期溫度25℃,在該條件下?lián)u瓶發(fā)酵阿維拉霉素的效價(jià)為820.83mg/L。

    表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test/℃

    表2 變溫發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of changing temperature fermentation

    表3 變溫發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表?Table 3 Variance analysis of orthogonal test of changing temperature fermentation

    2.1.3 罐上變溫發(fā)酵驗(yàn)證 按1.2.2中的罐上發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株的罐上變溫發(fā)酵,其中發(fā)酵溫度根據(jù)生長(zhǎng)期28℃,阿維拉霉素合成期25℃進(jìn)行分段調(diào)控??疾炀旯奚献儨匕l(fā)酵過(guò)程各代謝參數(shù)的變化,結(jié)果見(jiàn)圖3、4。

    由圖3pH-時(shí)間曲線可知,發(fā)酵前期,Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌體生長(zhǎng),消耗培養(yǎng)基內(nèi)的速效碳源,分解糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生酸、醇等小分子物質(zhì),使得發(fā)酵初期pH下降。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,培養(yǎng)基中糖逐漸缺乏,pH開(kāi)始上升。在2~4d,由于培養(yǎng)基中的氮源被分解利用后產(chǎn)生NH3,所以在糖代謝和氮代謝的綜合作用下,pH迅速上升。之后菌絲體大量積累,代謝產(chǎn)物的合成速度加快,而由于碳酸鈣的存在,pH的變化很小。

    圖3 罐上變溫發(fā)酵培養(yǎng)基pH及還原糖變化曲線Figure 3 Time course of pH and reducing sugar in a 10Lfermenter

    由還原糖-時(shí)間曲線可知,發(fā)酵初期由于菌體生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)合成酶分解淀粉,使得發(fā)酵液中還原糖含量出現(xiàn)略有升高的現(xiàn)象。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵液中還原糖含量呈下降的趨勢(shì)。發(fā)酵前期,發(fā)酵液中還原糖含量下降速度快。第4天之后,發(fā)酵液中還原糖含量接近15mg/mL。隨著發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入后期,發(fā)酵液中還原糖含量下降的趨勢(shì)變得緩慢,發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中還原糖的含量為8.79mg/mL。

    圖4 罐上變溫發(fā)酵菌體濃度及效價(jià)變化曲線Figure 4 Time course of cell volume and titer in a 10Lfermenter

    由圖4菌體濃度-時(shí)間曲線可知,10L發(fā)酵罐罐上發(fā)酵過(guò)程中,菌體在發(fā)酵前期生長(zhǎng)旺盛,菌體濃度增加速度快。發(fā)酵時(shí)間達(dá)到4d之后菌體濃度增加速度變慢,所以第4天之后發(fā)酵溫度調(diào)至25℃。而發(fā)酵10d之后由于發(fā)酵罐中培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不足,菌體開(kāi)始自溶,菌體濃度也略有下降。

    由效價(jià)-時(shí)間曲線可知,0~4d主要為菌體的生長(zhǎng)期,只有很少量的阿維拉霉素合成。4d之后開(kāi)始進(jìn)入阿維拉霉素合成期,此時(shí)發(fā)酵溫度為25℃,菌體合成阿維拉霉素速度快,阿維拉霉素不斷積累。8d之后發(fā)酵液中阿維拉霉素產(chǎn)量增加緩慢。第10、11天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量為960mg/L左右,并且變化很小,說(shuō)明此時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量已達(dá)到最大值。因此 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N-0104 菌 株 的10L發(fā)酵罐罐上變溫發(fā)酵周期為10d,其中0~4d為菌體生長(zhǎng)期,5~10d為菌體阿維拉霉素合成期。

    2.1.4 罐上變溫發(fā)酵與恒溫發(fā)酵比較 將2.1.3中的Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株罐上變溫發(fā)酵阿維拉霉素產(chǎn)量與菌株罐上恒溫發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)圖5。

    由圖5可知,當(dāng)Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株進(jìn)行罐上恒溫發(fā)酵時(shí),在第11、12天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量變化已經(jīng)很小,達(dá)到最大值735.27mg/L,可以確定菌株罐上恒溫發(fā)酵的周期為11d。當(dāng)菌株進(jìn)行罐上變溫發(fā)酵時(shí),第10、11天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量沒(méi)有明顯差異,達(dá)到最大值963.28mg/L,比恒溫發(fā)酵的產(chǎn)量提高了31.01%,并且菌株罐上變溫發(fā)酵的周期為10d。說(shuō)明罐上變溫發(fā)酵不僅能促進(jìn)菌株合成阿維拉霉素,而且能縮短菌株的發(fā)酵周期。

    圖5 恒溫發(fā)酵與變溫發(fā)酵結(jié)果比較Figure 5 Comparison of variable temperature fermentation result and constant temperature fermentation result

    2.2 罐上發(fā)酵pH調(diào)控

    pH值的大小不僅會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中酶的活性,還會(huì)影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分和中間代謝產(chǎn)物的解離程度,從而影響到菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成等。在Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株罐上變溫發(fā)酵過(guò)程中,在控制培養(yǎng)基滅菌后pH為7.1左右的基礎(chǔ)上,對(duì)菌體阿維拉霉素合成期的pH進(jìn)行聯(lián)動(dòng)調(diào)控,并以不進(jìn)行pH調(diào)控的發(fā)酵為對(duì)照組,結(jié)果見(jiàn)圖6。

    圖6 pH對(duì)產(chǎn)阿維拉霉素的影響Figure 6 Influence of pH on avilamycin production

    由圖6可知,當(dāng)調(diào)控合成期pH為7.5時(shí),Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株產(chǎn)阿維拉霉素的產(chǎn)量最高,為1 087.40mg/L,比對(duì)照組的產(chǎn)量(963.28mg/L)提高了12.89%。雖然堿性條件有利于阿維拉霉素的合成,但是當(dāng)調(diào)控阿維拉霉素合成期pH在8.0和8.5時(shí),由于一定程度上影響到發(fā)酵過(guò)程中一些前體物質(zhì)的合成及酶的活性,所以阿維拉霉素的產(chǎn)量相對(duì)降低。

    3 結(jié)論與討論

    阿維拉霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵過(guò)程可以分為前期的生長(zhǎng)期和后期的阿維拉霉素合成期,因此本試驗(yàn)通過(guò)分段調(diào)控,并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì) Streptomyces viridoehrongenes N-0104菌株罐上發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)微生物檢定法測(cè)定,采用優(yōu)化后的罐上發(fā)酵條件所得的阿維拉霉素產(chǎn)量為1 087.40mg/L,較初始的產(chǎn)量(735.27mg/mL)提高了47.89%。說(shuō)明阿維拉霉素產(chǎn)生菌罐上發(fā)酵分段調(diào)控能有效地提高阿維拉霉素的產(chǎn)量,這對(duì)阿維拉霉素的產(chǎn)業(yè)化具有很重要的意義。

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